水牛卵母细胞核仁内DNA的分布及rRNA转录位点的研究

本研究利用透射电镜技术、激光共聚焦显微镜技术以及单细胞凝胶电泳技术等，结合常规染色、DNA特异染色、免疫标记对G1期、S期、G2期以及冷冻复苏后的卵母细胞核仁的超微结构及其变化、核仁中DNA的分布及其变化、核仁rRNA基因转录位点及其变化进行了研究，试图阐明①核仁周期内核仁形态和结构组分的变化；②rDNA在核仁周期内的原位分布和结构构型的变化；③玻璃化冷冻后的水牛卵母细胞解冻后的超微结构变化；④玻璃化冷冻后的水牛卵母细胞解冻后rDNA在核仁内的分布和结构构型的变化；⑤玻璃化冷冻保存过程和冷冻保护剂处理对细胞DNA的影响程度。这些研究有助于解决核仁中rDNA的分布和转录位点问题的分歧，对于了解核仁的结构与功能的关系，以及核仁中rRNA基因的转录位点和高效转录机制具有重要意义，并为进一步研究水牛卵母细胞核仁的结构和功能、玻璃化冷冻机制、提高冷冻保存效果提供新的实验数据。

随着胚胎工程技术的发展，如何保存卵母细胞来满足日益增加的需求成为研究者关注的热点。玻璃化冷冻具有经济实用，快速有效的特点，但仍存在诸多问题，而且在冷冻过程中对卵母细胞超微结构、细胞DNA水平上的损伤机制等方面研究较少。本研究以卵母细胞作为试验材料，就目前应用最多的七种冷冻保护液配方进行筛选，发现GV期、MII期卵母细胞最佳冷冻液配方为HM+20% EG+0.5mol/Lsu，HM+40%EG+0.5mol/L Su和HM+7.5% (DMSO+EG)，HM+17% (DMSO+EG)+0.4mol/LSu；比较三种不同冷冻载体的效果差异，发现半麦管法更适合卵母细胞的玻璃化冷冻；利用OCTAX PolarAIDE系统和Hoffman系统对冷冻前后卵母细胞透明带双折射值和厚度进行检测，结果发现玻璃化冷冻导致卵母细胞透明带双折射值（0.30±0.38VS1.22±0.21）和厚度（5.05±0.10VS5.77±0.60）降低，表明玻璃化冷冻对卵母细胞透明带双折射值和厚度造成了不良影响；运用荧光显微镜检测了冷冻前后透明带CD9蛋白的表达，发现冻存过的卵母细胞CD9表达水平与对照组的表达水平相比差异显著（1.1%VS100%；68.4%VS22.9%）；通过透射电镜观察卵母细胞冷冻前后的超微结构变化，结果发现冻后GV期卵母细胞微绒毛消失，线粒体肿胀并伴有囊泡样结构，内质网不完整，胞质内溶解为絮状。冻后MII期卵母细胞透明带损伤、微绒毛、细胞膜损伤甚至消失、极少量皮质颗粒分布于皮质区。脂滴部分溶解，脂滴周围伴随大量肿胀呈圆形的线粒体；采用改进的NAMA-Ur DNA特异染色法观察核仁中DNA的分布情况，结果发现GV期卵母细胞的细胞核为不规则圆形，核仁为规则圆形，核仁外核仁相随染色质包围整个核仁，分布明显，但核仁的三个分区不明显；采用彗星电泳方法分析了冷冻对卵母细胞造成的DNA损伤情况，结果发现GV期卵母细胞玻璃化冷冻组TailDNA%为31.9%与冷冻保护剂处理组17.29%和对照组14.13%差异显著。MII期卵母细胞冷冻组TailDNA%29.55%与冷冻保护剂处理组19.22%和对照组11.06%差异显著，表明冷冻导致明显的DNA损伤。以上研究结果为成功冷冻卵母细胞能应用于生产实际提供理论支持，并为进一步研究卵母细胞玻璃化冷冻机制、提高冷冻保存效果提供新的实验数据。