玻璃化冷冻对卵母细胞线粒体损伤及其机理的研究

The cryodamage of oocyte was paid more attention as the main obstacle of oocyte cryopreservation. At present, the research of oocyte cryodamage on mitochondrial damage has fewer reports, mainly concentrates on the microtubule, microfilament and chromosome damage. The subject will detect ①The changes of structure and distribution on mitochondria by vitrification; ② The changes of malondialdehyde, ATPase and the membrane potential on mitochondrial membrane; ③The changes of the level of ROS, mtDNA damage and ATP content in the oocyte by vitrification; ④Effect of ROS on poly and mtTFA protein that related to mtDNA replication and injury repair; ⑤The change of lysosome activity in the oocyte, in order to clarify whether refrigeration regulates the expression of mtDNA replication and repair related proteins and the change of lysosome activity in the cell through ROS-depend pathway, thus leading to mtDNA damage and affecting the mitochondrial function of the oocyte. By clarifying the effects on the mitochondria after vitrification of oocyte to discuss the possible mechanism of effect of refrigeration on mitochondrial function in oocyte. It provides new thoughts to guide the vitrification of oocyte and experimental references for further discussion of the mechanism that affect oocyte cryopreservation.

卵母细胞的冷冻损伤作为卵母细胞冷冻保存的主要障碍越来越受到研究者的关注，目前对卵母细胞冷冻损伤的研究主要集中在微管、微丝和染色体损伤上，而对线粒体损伤的研究报道较少。本课题拟通过多种实验手段检测①冷冻前后卵母细胞内线粒体的结构和分布变化；②测定线粒体膜上的丙二醛、ATP酶及膜电位的变化；③研究冷冻前后卵母细胞内ROS水平的改变、mtDNA损伤情况及ATP含量变化；④探讨ROS对mtDNA复制及损伤修复相关蛋白poly和mtTFA的影响；⑤检测卵母细胞内溶酶体活性变化，以期阐明冷冻是否通过ROS依赖途径调控mtDNA复制及修复相关蛋白的表达及细胞内溶酶体活性变化，导致mtDNA损伤并影响卵母细胞线粒体功能。以澄清卵母细胞玻璃化冷冻后，对线粒体造成的影响，来探讨冷冻对卵母细胞内线粒体功能影响的可能机制，为指导玻璃化冷冻卵母细胞提供新的思路，为进一步探讨影响卵母细胞冷冻保存的机理提供实验参考。

卵母细胞冷冻保存是保护种质资源的有效手段，因此卵母细胞的冷冻损伤及其机理的研究越来越受到研究者的关注。为了澄清卵母细胞玻璃化冷冻后对线粒体造成的影响，探讨冷冻对卵母细胞内线粒体功能影响的可能机制，本研究通过对比四组常见常用的玻璃化冷冻液对卵母细胞发育能力的影响，筛选出对卵母细胞发育潜力损伤最小冷冻液配方：（HM+7.5%（DMSO+EG），HM+15%（DMSO+EG）+0.5mol·L-1 Su）；利用透射电镜技术发现冷冻组卵母细胞冻融后有不同程度的结构损伤，主要表现为胞质中的中间纤维解体，微绒毛变短甚至缺失，线粒体粗糙模糊，胞质外围皮质颗粒数量减少，透明带变得模糊不清、有的地方甚至已经破裂，细胞基质出现大量空泡，并形成有线粒体－空泡复合体；利用生物化学发光法、酶联免疫吸附法检测卵母细胞线粒体膜电位值和线粒体分布情况以及ROS含量和溶酶体变化，发现冷冻后线粒体膜电位值、线粒体正常分布率和ATP含量下降，ROS含量上升，溶酶体分布变得扩散；通过酶标仪检测β-半乳糖苷酶及8-OHdG浓度变化，发现玻璃化冷冻使小鼠卵母细胞内β-半乳糖苷酶活性显著升高，卵母细胞8-OHdG浓度显著增加；利用半定量PCR、实时定量PCR、western blotting等实验技术手段，发现玻璃化冷冻对卵母细胞mtDNA损伤产生影响，具体表现在玻璃化冷冻使卵母细胞mtDNA拷贝数降低，3867bp片段缺失。结果表明，玻璃化冷冻可以通过ROS依赖途径调控mtDNA复制及细胞内溶酶体活性变化，导致mtDNA损伤并影响卵母细胞线粒体功能。本研究结果为指导玻璃化冷冻卵母细胞提供新的思路，为进一步探讨影响卵母细胞冷冻保存的机理提供实验参考。