核仁蛋白hRrp15调节rRNA转录、加工和细胞增殖的分子机制研究

Nucleoli are the sub-organelles that control ribosome biogenesis of cells，which regulate proliferation, differentiation, and response to stress stimulation of the cells. It is demonstrated that many nucleolar and ribosomal protein can participate stress response process. Our previous study suggested that hRrp15 is a nucleolar protein, whose function is dissimilar to its yeast homology Rrp15p. It is a component of both large and small ribosomal subunits. Depletion of hRrp15 induce distruction of nucleolus structure and disperse of nucleolin into nucleoplasm. In addition, hRrp15 knockdown inhibit both large and small subunits ribosome biogenesis. More interesting, we found that depletion of hRrp15 in non-transformed cells, RPE1, induced cell cycle arrest at G1-G1/S with upregulated p53 and p21, whereas depletion of hRrp15 in human tumor cells, HeLa, caused DNA damage response with detectable γH2AX and apoptosis. In this project, we intend to clarify the mechanism that how hRrp15 regulate ribosome biogenesis and cell proliferation based on our previous study. Our project is aimed to shed a new light oninsight for hRrp15 function and provide novel insight in cancer targeting therapy.

核仁是细胞内核糖体生物发生的场所，并通过控制核糖体生物发生调节细胞的增殖、分化以及对外界刺激的应答等生命活动。核仁及核糖体蛋白参与外界刺激应答已成为相关领域研究的热点。酵母Rrp15p已报道参与核糖体大亚基生物发生，我们发现其在人细胞中的同源物hRrp15是一个核仁蛋白，且同时存在于核糖体大小亚基前体中。利用RNAi技术抑制hRrp15表达后，细胞核仁结构被破坏，核仁素蛋白弥散到细胞核基质中；核糖体大小亚基生物发生均受到明显抑制。在非转化细胞RPE1和肿瘤细胞HeLa中分别抑制hRrp15表达后，RPE1发生细胞周期阻滞，细胞周期停滞于G1-G1/S期，细胞内p53和p21表达水平明显升高；而HeLa发生细胞凋亡，且伴随着DNA损伤反应的出现。本课题旨在进一步研究hRrp15调控核糖体生物发生和细胞增殖的机制，从而阐明该蛋白分子的重要生理功能，为以该分子为靶标的肿瘤治疗奠定理论基础。

核仁是细胞内核糖体生物发生的场所，并通过控制核糖体生物发生调节细胞的增殖、分化以及对外界刺激的应答等生命活动。核仁及核糖体蛋白参与外界刺激应答已成为相关领域研究的热点。酵母Rrp15p已报道参与核糖体大亚基生物发生，通过免疫荧光实验，我们证实Rrp15p在人细胞中的同源物RRP15定位于核仁区域，且同时存在于核糖体大小亚基前体中。利用RNAi 技术抑制RRP15 表达后，细胞核仁结构被破坏，核仁marker nucleolin、Fibrillarin和UBF均弥散到细胞核基质中。同时，通过ChIP实验我们发现RRP15可以直接结合rDNA区，并通过影响RNA聚合酶I（RNA polymerase I）基本转录装置RPA-194及其转录因子UBF与rDNA区的结合影响rDNA的初始转录，进而控制核糖体大小亚基的生物发生。抑制RRP15表达后，在p53正常的非转化细胞RPE1 中导致依赖于RPL5/RPL11/5S rRNA (RP)-Mdm2-p53途径的G1-G1/S周期阻滞；而在p53异常的肿瘤细胞HeLa 和MCF7中，由于p53的功能异常，RRP15的表达抑制不能使细胞阻滞在G1/S期，而是进入S期，但由于核糖体生物发生的抑制，导致蛋白翻译受到影响，使DNA合成或DNA损伤修复相关的蛋白缺乏，最终激活ATR-Chk1-rH2AX DNA损伤反应，使细胞阻滞在S-G2/M期，最终走向凋亡。本课题的研究阐明了RRP15调节核糖体生物发生分子机制，同时，干扰RRP15表达后在正常细胞和肿瘤细胞中产生的不同效应，为以RRP15作为分子靶标的肿瘤治疗奠定了理论基础。