表征天然丰度酵母细胞色素c多构象的液体14N NMR方法研究

Functionally related conformational heterogeneity of proteins is becoming a new research hotspot. NMR is a powerful probe for the study of protein structure and dynamics with atomic resolution. However, it is hard to obtain a single conformer related to a specific function for proteins with conformational heterogeneity. Exogenously selective labeling methods are usually employed to differentiate different conformers, which may be complex, costly and lead to results deviated from original facts. Therefore, developing new endogenous probe to study functionally related conformational heterogeneity of proteins is meaningful. Cytochrome c is a representative protein, which possesses several conformers exhibiting important biological functions in respiration and apoptosis. Exploring functionally related conformational heterogeneity of cytochrome c is helpful to understand the relevant mechanism accurately. In this project, we will develop liquid 14N NMR based methods to study functionally related conformational heterogeneity of yeast iso-1-cytochrome c at natural abundance. The implement of this project will be helpful for understanding the relation between structures and functions of yeast iso-1-cytochrome c and meaningful for making liquid 14N NMR to be a new endogenous probe for protein dynamics at natural abundance.

蛋白质功能相关的多构象现象正成为新的研究热点。核磁共振波谱（NMR）是一种非常有效的获得生物大分子原子水平结构及动力学信息的技术.然而，对于同时存在多种构象的蛋白，由于很难获得与某一特定功能相关的单一构象，通常需要外源标记技术以区分不同的构象，这些方法往往操作复杂、费用昂贵、而且可能影响目标蛋白的固有性质。因此，发展新的内源探针来表征多构象蛋白具有非常重要的意义。细胞色素c是一种非常典型的存在多种构象且行使多种生物学功能的蛋白质，同时在呼吸作用和细胞凋亡中起重要作用，研究细胞色素c的多构象现象对于人们理解细胞色素c如何发挥其功能有重要的帮助。本项目中，申请人将发展基于液体14N NMR的蛋白质动力学表征方法，并以此为探针研究天然丰度酿酒酵母iso-1细胞色素c功能相关的构象转变。项目的顺利实施会帮助人们理解细胞色素c结构与功能的关系，也将为天然提取蛋白质的动力学研究提供新的技术方法和路线。

细胞色素c是一种重要的多功能多构象蛋白质，在生物体的呼吸作用和细胞凋亡中发挥重要作用。根据外界条件的不同，为了行使不同的功能，细胞色素c表现出多种不同的构象。对细胞色素c多构象的表征是理解其功能机制的关键。NMR是研究蛋白质构象转变和互作动力学的有效方法，但是几乎所有蛋白质NMR方法均依赖于大肠杆菌重组表达的同位素标记甚至选择性同位素标记样品，这对于转录后修饰蛋白或难以通过大肠杆菌表达的蛋白是一种致命的限制。在本项目中，我们根据14N NMR线宽随原子核周围电场对称性增加而减小的基本原理，发展了适合生物大分子的1H-14N 异核单量子相关技术，以细胞色素c三甲基修饰的72位赖氨酸为探针，在天然丰度下成功实现了无标记细胞色素c的多种构象同时检测。我们发现，细胞色素c在碱性条件下会转变成两种碱性构象，同时伴随生成一种Heme基团暴露的过氧化酶活性构象，证实其为细胞色素c在碱性条件下表现出高过氧化酶活性的原因。由于该技术具有极佳的信号选择性，我们将该技术推广到活细胞体系，实现了酿酒酵母生长过程中的细胞膜中的胆碱类衍生物含量变化的在线检测。综上，本项目发展了适合生物大分子的1H-14N异核单量子相关技术，该技术具有极高的信号选择性，是极少数可以在天然丰度无标记条件下实现复杂生物系统研究的NMR方法，在蛋白质甲基化修饰研究中具有较好的应用前景。