不同细胞Toll样受体4参与心脏骤停心肺复苏后脑损伤机制研究

研究证明心搏骤停（CA）和心肺复苏(CPR)所导致脑缺血再灌注（I/R）损伤是CPR后脑损伤重要发病机制，小胶质细胞、髓系细胞以及脑血管内皮细胞在此病理过程中扮演重要角色。已知Toll样受体4（TLR4）介导脑I/R炎性损伤，最新研究证明在脂多糖诱导的脑组织炎症免疫过程中，不同细胞TLR4在脑组织招募中性粒细胞(PMN)过程中作用并不相同。那么在CA/CPR导致脑I/R炎性损伤过程中，哪种细胞在脑组织招募PMN过程中扮演关键角色，不同细胞又是如何通过TLR4来参与CA/CPR后脑损伤？为此本课题拟在已有的研究基础上，运用骨髓移植和化学药物清除的方法创建细胞差异性表达TLR4基因的嵌合体动物，以此为对象复制CA/CPR模型，研究髓系细胞、脑血管内皮细胞以及小胶质细胞TLR4的表达与CA/CPR后脑组织损伤的关系及作用机制，阐明在CA/CPR后脑损伤发生发展过程中起决定作用的细胞。

本课题拟运用骨髓移植和化学药物清除的方法创建细胞差异性表达TLR4基因的嵌合体动物，以此为对象复制心脏骤停心肺复苏（CA/CPR）模型，研究不同细胞表面TLR4的表达与CA/CPR后脑组织损伤的关系及作用机制。首先本课题组在既往研究基础上，在国内首次成功构建以冰氯化钾溶液静推的方法制作小鼠CA/CPR模型，并以此模型为基础较为详细的观察了TLR4基因缺失小鼠和野生型小鼠CPR后72小时生存率、复苏术后行为学和脑组织形态学改变、TLR4及其信号通路在CPR后脑组织中的表达变化规律。我们发现野生型小鼠复苏生存时间较TLR4基因缺失型小鼠短，而且形态学提示脑组织损伤程度加重，血清和脑组织内炎性因子(TNF-α)和粘附分子(ICAM-1)均表达明显升高，提示TLR4蛋白的激活表达是作为重要炎性受体介导CPR后脑缺血炎性损伤。其次，基于构建CA/CPR小鼠模型，我们观察了不同心脏骤停（CA）持续时间后开始心肺复苏，复苏后小鼠肾脏的损伤与TLR4之间的关系。结果提示随着CA时间的延长，小鼠TLR4表达明显升高，TLR4信号通路相关炎症因子表达也进一步增高，而且这与CPR后的急性肾损伤呈现正比例关系。最后，我们还开展了骨髓移植模型的构建工作，成功构建了不同TLR4基因型小鼠间的嵌合体模型，并且通过检测雄性供体鼠雄性蛋白基因SRY在雌性受体鼠髓系细胞的表达，验证了骨髓移植模型的成功。我们还观察了米诺环素对心肺复苏后小鼠的脑保护作用，发现米诺环素可以抑制复苏后脑组织小胶质细胞的激活和神经元的死亡。此外，基于前期我们练习血管插管时构建的小鼠局灶性脑缺血再灌注模型，我们还检测了新发现的TLR4的内源性配体S100A8和A9的表达变化，结果提示S100A8和A9很有可能作为内源性TLR4配体介导脑缺血再灌注损伤，这为进一步研究TLR4信号通路在CPR后脑缺血再灌注损伤奠定了基础。我们也利用此模型观察了不同TLR4基因型脑缺血再灌注损伤后心肌炎症因子以及心肌损伤的变化规律，提示TLR4在脑缺血再灌注的心肌组织损伤中发挥重要作用。