酵母发酵产物诱导其线粒体细胞色素C释放行为的拉曼光谱研究

酵母发酵工业中，大量积累的代谢产物酒精、乙酸等会通过诱导线粒体中包括细胞色素C（Cyt-c）在内的内含物的释放来启动酵母的凋亡，引起细胞大量死亡。但到目前为止，线粒体内Cyt-c释放的确切机制仍未清楚。本课题应用单细胞拉曼光谱分析技术，以酵母为对象，以其代谢产物酒精，乙酸等作为凋亡的诱导剂，在单个线粒体水平上实时记录线粒体Cyt-c 浓度变化过程以及其释放行为的拉曼光谱特征，运用光谱学及化学计量学知识，结合多元数理统计分析原理，分析所记录的光谱数据。从这些特征拉曼光谱与酵母内部的生物大分子之间的内在联系，以及与这些生物大分子变化过程的关联性，阐述酵母线粒体被代谢产物胁迫后脂膜的微观损伤、流动性和通透性的变化特性，在取得大量Cyt-c的释放动力学数据基础上构建数学模型，描述Cyt-c释放过程的行为特性，明确Cyt-c的释放通道，揭示其释放机理，为筛选耐高酒精浓度等优良菌株提供理论依据。

项目建立灵敏、特异和可靠的单细胞拉曼光谱系统（LTRS），在单细胞和单线粒体水平上，实时记录酵母个体和单个线粒体分别在乙酸、乙醇胁迫条件下蛋白质、核酸、脂类等大分子拉曼光谱变化过程，尤其细胞色素C变化过程以及其释放的行为特征。项目取得的主要结果是①构建了可编程温度控制实验平台，实现实验过程温度灵活控制。②建立简单易行，成本低酵母同步细胞分离纯化方法，使得具备一般实验条件的普通实验室，用常用的PC离心管，在只装备固定角转头的高速离心机上进行操作，就可以获得同步化细胞。③乙酸、乙醇、UV胁迫酵母细胞凋亡过程中，LRTS单细胞分析技术长时间监控一个细胞，可以获得每个细胞在单位小时内生物大分子变化过程的实时数据，可以真实反映出单个细胞在胁迫过程中的生理变化特性和动态变化，能够发现基于群体水平上被掩盖的细节，包括酵母细胞在凋亡过程中，质膜结构的完整性以及流动性发生改变，造成细胞内含物包括蛋白质、脂类、核酸，细胞色素C等大分子外流，细胞活性以及能量代谢逐渐降低，蛋白质合成和降解时间点等信息。基于LTRS的单个细胞分析技术，能够克服群体分析中平均结果对个别信息掩盖的局限性，是细胞生命分析技术对传统技术的挑战，本研究对于细胞学研究有重要的意义。④比较乙酸、乙醇胁迫细胞后提取线粒体的光谱变化，和直接胁离体迫线粒体的光谱变化，两者的趋势一致，说明胁迫物进到细胞后直接作用于线粒体。⑤乙酸、乙醇胁迫酵母细胞凋亡过程中，线粒体质膜是主要的靶点，导致大分子通透性转移孔道(mitochondrial permeablize transition pore,MPTP)被打开，造成线粒体渗透压的改变以及大量消耗ATP，引起线粒体肿胀，最终引起线粒体膜的破裂，线粒体内含物随着释放包括细胞色素C的释放启动线粒体介导的细胞凋亡。⑥致死浓度乙酸、乙醇胁迫细胞和离体线粒体，LTRS都是在15分钟后才检测到线粒体细胞色素C随释放，说明乙酸、乙醇作用于线粒体过程有累积效应，最后才导致线粒体膜的破裂，这是LTRS的单个细胞实时分析技术的优势。