网格蛋白介导的内吞在绿僵菌孢子耐热中的作用机理

Metarhizium is an insect pathogenic fungi widely used as a biocontrol agent, low thermotolerance of conidia is the main impediment to the efficiency of field applications and the level of commercialization. In our preliminary studies, thousands of up-regulated genes were identified by differential expression analysis at the transcriptome level in heat-treated conidia, and the results of KEGG pathway enrichment analysis show the endocytosis pathway was most significantly enriched pathway for up-regulated genes. In Eukaryote, Clathrin-mediated endocytosis(CME) has many effects on signal transduction and, conversely, actin signalling can regulate CME; and therefore it play an important roles in the stress response. However, little is known about related research for entomopathogenic fungi...Based on the preliminary work, firstly, functions of gene Chc(key gene in CME) and Ark1(that control CME through regulating actin signalling in model fungi) will be analyzed and identified by gene deletion/complementation and Confocal microscopy, therefore effects on the conidial thermotolerance of CME will be confirmed. Secondly, experimental methods,such as high-throughput sequencing and quantitative phosphoproteomics, will be employed to identify signaling pathways and key proteins in the intertwining molecular networks of CME and actin signalling, and therefore the regulatory mechanism of CME in thermotolerance of Metarhizium conidia will be clarified.The findings should provide a theoretical basis for the genetic improvement of the production strain of Metarhizium.

绿僵菌是一类应用于生防的昆虫病原真菌，孢子耐热差限制了其大田应用效率和商品化程度。我们近期发现：在罗伯茨绿僵菌孢子热胁迫过程中存在数千上调基因，经pathway分析显著富集于内吞途径。在真核生物中，网格蛋白介导的内吞途径（CME）直接调控胞内外信号传递，反之，CME也可被actin等信号通路调控；因而在逆境胁迫应答等过程中起重要作用。但鲜有昆虫病原真菌的相关研究报道。本项目在前期基础上，采用基因敲除/回补和激光共聚焦显微观察等技术，分析绿僵菌Chc（CME的关键基因）和Ark1（模式真菌中，作用于actin信号通路调控CME）基因对孢子CME及耐热力的影响，从而明确CME对孢子耐热力的作用；结合深度测序和定量磷酸化蛋白质组等手段鉴定孢子耐热中CME调控的信号通路及actin信号通路调控CME的关键分子，阐明CME在孢子耐热中的作用机理；为真菌杀虫剂田间适应性和稳定性的遗传改良提供理论依据。

绿僵菌是一类广泛应用于生物防治的昆虫病原真菌，孢子耐热性差限制了其商品化程度和大田应用效率。因此，关于绿僵菌及其他生防真菌孢子耐热的分子机理仍有待进一步加深。前期工作中已经发现绿僵菌孢子热胁迫过程中Ark1和Chc基因表达显著上调。在此基础上，本项目以罗伯茨绿僵菌为研究对象，从如下3个方面进行了深入研究：首先，通过利用基因敲除、回补技术获得MrArk1的敲除和回补转化子，分析并明确MrArk1在绿僵菌内吞及耐热力、致病等过程中的作用；第二，利用MrArk1的基因敲除株和野生型在特定热胁迫处理条件下的差异转录组分析，鉴定MrArk1所影响的下游信号通路及调控的关键基因；第三，利用基因敲除并结合生化技术，阐明MrArk1下游关键基因的功能和调控机制。此外发现绿僵菌Chc基因无法敲除，可能为致死基因。具体结果如下：（1）针对绿僵菌MrArk1的生物学功能的分析，结果发现：MrArk1参与绿僵菌胞吞作用，MrArk1基因敲除导致绿僵菌对热更敏感（即热耐受能力下降）、生长速率降低、产孢量和毒力显著下降。（2）针对MrArk1的基因敲除株和野生型在特定热胁迫处理条件下的差异转录组分析，结果发现数百个差异表达基因，这些差异表达基因主要富集于泛素介导的蛋白水解（Ubiquitin mediated proteolysis）、细胞周期、脂肪酸代谢和丙酮酸代谢途径以及MAPK信号通路等，同时鉴定了数个MrArk1所调控的参与抗逆相关差异表达基因（例如MrUBI4、MrPex33及MrUbp4等）。（3）通过基因敲除技术，针对绿僵菌MrArk1所调控的下游基因MrUBI4及MrPex33的生物学特性分析；结果发现：相比较于野生型，MrUBI4敲除突变菌株对热和UV胁迫更敏感，产孢量显著降低，毒力无变化；MrPex33敲除突变菌株对化学试剂胁迫更敏感，体壁侵染的毒力显著降低，进一步地机制分析发现敲除菌株的附着胞形成率以及角质层穿透能力显著下降。此外，项目研究也建立了eGFP与mCherry共定位分析的方法并观察发现MrPex33定位于绿僵菌过氧化物酶体。总之，这些结果的获得拓展了人们对绿僵菌等昆虫病原真菌孢子热胁迫应答分子机制的理解，也为进一步通过分子设计创制耐热工程菌株提供了理论基础。