候选衰老逃匿基因Foxa2在早衰中的作用及表观遗传调控机制

前期研究提示Foxa2为候选的衰老相关差异甲基化基因，且其缺陷细胞株显示早衰表型。本研究在已建立的人胚肺成纤维细胞Foxa2缺陷细胞株基础上，拟构建Foxa2高表达细胞株；建立过氧化氢诱导的细胞早衰模型；结合快速老化小鼠亚系SAMP2及抗快速老化小鼠亚系SAMR1动物实验；系统分析Foxa2在体内外早衰过程中的生物学功能。应用甲基转移酶抑制剂DAC和去乙酰基转移酶抑制剂TSA进行干预，确定Foxa2基因表达受表观遗传调控；进而应用亚硫酸氢盐测序、甲基化特异性PCR、定量染色质免疫沉淀等表观遗传研究方法，综合分析Foxa2启动子区DNA甲基化和组蛋白修饰密码的动态变化，并明确与Foxa2表观遗传调控相关的酶或结合蛋白，从而阐明Foxa2在早衰过程中的表观遗传调控机制。本研究为寻找早衰发生的表观遗传生物学标志，进行早衰及相关性疾患的靶向基因表达调控的表观遗传干预提供理论依据和新的思路。

本课题为验证候选衰老逃匿基因Foxa2在早衰中的作用及其表观遗传学调控机制，利用已获得的人胚肺成纤维细胞体外复制性衰老模型、建立过氧化氢诱导早衰模型及构建慢病毒转染Foxa2过表达细胞株，通过荧光定量PCR、免疫印迹、免疫荧光、亚硫酸氢盐测序、甲基化特异性PCR（MSP）、定量染色质免疫沉淀（Q-ChIP）等方法，发现在细胞复制性衰老及早衰过程中，表观遗传微环境随衰老进程而变化，基因组DNA整体甲基化水平逐渐降低，组蛋白H3、H4整体乙酰化水平逐渐降低，组蛋白H4K20me3整体甲基化水平逐渐升高；细胞Foxa2的mRNA与蛋白表达逐渐降低，衰老细胞具有低水平的Foxa2，证实Foxa2逃匿细胞衰老的发生。应用甲基转移酶抑制剂DAC和去乙酰基转移酶抑制剂TSA处理衰老细胞后，可逆转Foxa2表达，表明Foxa2表达受表观遗传学调控；衰老细胞中Foxa2启动子区具有较高水平的新生DNA甲基化，而降低的组蛋白H3乙酰化和H4K3me3以及升高的H4K20me3修饰是其特定的组蛋白修饰模式，联合调控基因表达。运用Q-ChIP-MSP，发现DNMT3b和MeCP2结合于Foxa2启动子区域，参与其DNA甲基化的发生。对衰老促进基因P66Shc研究，发现其启动子区高甲基化水平不参与细胞衰老发生，而特定的组蛋白修饰模式参其表达调控，揭示特定基因的表观遗传模式参与控制细胞衰老表型。进行2月龄、4月龄及10月龄快速老化小鼠亚系SAMP8和同月龄的抗快速老化小鼠亚系SAMR1在体实验，早衰小鼠Foxa2的mRNA和蛋白表达均降低，其启动子区域DNA甲基化水平较低，不参与基因表达调控，而组蛋白H3和H4乙酰化参与联合调控基因表达，揭示体内外早衰的表观遗传调控存住差异。检测Foxa2下游靶基因apoA-I，Foxo1，Foxo3，MMP1及PDX1mRNA表达，与Foxa2变化趋势一致，表明表观遗传学的调控效应涉及下游靶基因的表达变化。本研究为体内外早衰过程中Foxa2表达变化及其表观遗传调控机制提供了新的资料，其转录调控区域的DNA甲基化及组蛋白修饰模式可作为早衰发生的表观遗传生物学标志，Foxa2可作为早衰及其相关性疾患进行干预尝试的靶基因，其下游靶基因的变化进一步表明表观遗传学调控机制参与基因表达调控网络，均与早衰发生密切相关，这为基础和临床的表观遗传学干预研究提供理论基础。