香菇内源型甲醛代谢关键酶的作用机理研究

香菇在生长发育和采后干燥过程中会逐步生成内源型甲醛，导致香菇中甲醛超标的食品安全问题。本项目以香菇内源甲醛代谢过程中涉及的2种代谢关键酶（γ-谷氨酰转肽酶和半胱氨酰亚砜裂解酶）为研究对象，拟采用现代分离技术、生物质谱序列分析手段、RACE分析方法和外源表达系统构建，从新鲜香菇子实体中分别分离和纯化出2种代谢关键酶，分析其氨基酸序列和cDNA全长序列，进而通过外源表达获取足量的关键酶，通过建立和研究酶促反应模拟体系，明确关键酶的作用底物类型、反应产物、酶促反应速度和相关酶学特性；通过研究2种关键酶在香菇体内基因表达水平和蛋白表达水平与酶活及甲醛生成量的相关性，明晰其在香菇中内源性甲醛产生历程中的分子机制，为有效调控香菇中甲醛含量，改善香菇及其制品的食品安全性提供理论基础。

香菇在生长发育和采后干燥过程中会逐步生成内源型甲醛，研究表明，香菇甲醛在代谢途径中涉及到两种关键酶，即γ-谷氨酰转肽酶和半胱氨酰亚砜裂解酶。本项目以香菇内源甲醛两种代谢关键酶为研究对象，研究了两种关键酶的分离、纯化、鉴定及其酶学特性，开展了两种关键酶的基因克隆、表达及其酶学特性研究，分析了两种关键酶在香菇生长发育过程中的表达特性与香菇内源型甲醛之间的关系。主要研究结果如下：.　　　(1) 两种关键酶的分离纯化及酶学特性。通过硫酸铵分级沉淀、阴离子交换层析和凝胶过滤层析三步纯化之后，得到电泳纯的两种关键酶，香菇内源型甲醛是在两种酶共同作用下产生的；γ-谷氨酰转肽酶的最适温度为37 °C，在20-50 °C范围酶活比较稳定，最适pH为8.8，在pH值8-10范围内酶活比较稳定；半胱氨酰亚砜裂解酶的最适温度为40 °C，在20-60 °C范围酶活比较稳定，最适pH为8.5，在pH值8-9范围内酶活比较稳定。.　　　(2) 两种关键酶的基因克隆、表达及酶动力学参数。获得两种酶的全长cDNA序列；γ-谷氨酰转肽酶基因编码582个氨基酸，理论分子量为62330 Da，理论等电点为5.83，不同物种γ-谷氨酰转肽酶的氨基酸序列对比显示香菇γ-谷氨酰转肽酶的氨基酸序列与极端微生物的γ-谷氨酰转肽酶具有相似的活性中心；半胱氨酰亚砜裂解酶基因编码497个氨基酸，理论分子量为54804 Da，理论等电点为6.13，不同物种半胱氨酰亚砜裂解酶的氨基酸序列对比显示香菇半胱氨酰亚砜裂解酶含有辅酶PLP结合位点和底物结合位点；构建了γ-谷氨酰转肽酶的大肠杆菌和毕赤酵母表达系统，酶活性分析表明，只有毕赤酵母表达的重组γ-谷氨酰转肽酶具有活性；构建了半胱氨酰亚砜裂解酶的大肠杆菌表达系统，重组半胱氨酰亚砜裂解酶具有活性；以γ-谷氨酰对硝基苯胺为底物，测得γ-谷氨酰转肽酶的Km值为12.05 mM；以S-甲基-L-半胱氨酸亚砜为底物测得半胱氨酰亚砜裂解酶的Km值为21.88 mM。.　　　(3) 香菇不同生长阶段两种关键酶的基因表达模式和甲醛含量。香菇不同生长阶段甲醛含量不同，未完全成熟香菇子实体中的甲醛含量是最高的，幼菇和完全成熟均略低于未完全成熟子实体。香菇不同生长阶段γ-谷氨酰转肽酶和半胱氨酰亚砜裂解酶基因均有表达，但表达量表现出差异。γ-谷氨酰转肽酶基因在香菇菌丝体阶段表达量比较高，不同