HIV-1 Tat蛋白诱导血脑屏障破坏及其作用机制

HIV-1 Tat是HIV-1编码的重要调控蛋白。基质金属蛋白酶 (MMPs) 是内源性蛋白水解酶。我们研究发现MMPs降解紧密连接蛋白（TJs）而参与Tat诱导的血脑屏障（BBB）破坏。促分裂原活化蛋白激酶(MAPKs)与MMPs活性和BBB完整性密切相关，但作用机制尚未清楚。本项目将阻断MAPKs信号传导研究 Tat诱导的MMPs和TJs表达的变化；利用siRNA抑制MMPs以观察其对Tat诱导的TJs表达和MAPKs信号传导的影响。通过凝胶迁移、染色质免疫沉淀和基因定点突变等研究MMP-9启动子上AP-1和SP-1转录因子对Tat诱导TJs表达的作用。最后动物验证抑制MMPs对Tat导致BBB功能失调的作用。本项目的完成将首次阐明Ras-Raf-Rho和JNK/SAPK通路和MMP2/9调节HIV-1 Tat诱导的血脑屏障破坏的作用机制，将有利于HIV感染的治疗。

HIV-1 Tat蛋白是HIV-1编码的重要调控蛋白。我们发现MMPs表达受ERK、Akt等MAPKs信号调节，MMPs通过降解紧密连接蛋白（TJS）而参与Tat蛋白诱导的血脑屏障（BBB）破坏,但其作用机制尚未清楚。本项目研究内容包括1.用抑制剂分别抑制MAPKs及MMPs以研究其调节Tat诱导TJS破坏机制。2.抑制MMP-9启动子转录因子以研究MMP-9调节Tat诱导TJS破坏机制。3.动物验证Tat对小鼠的脑微血管MMPs和TJS表达的影响。4.检测MMP-9 基因敲除鼠中Tat对TJS的影响。本项目发现了：1.PPARα激动剂非诺贝特和PPARγ激动剂罗格列酮抑制经颈内动脉注入的Tat诱导的脑微血管通透性增加，而PPARγ拮抗剂GW9662 加重通透性破坏。非诺贝特还通过ERK1/2 和 Akt信号通路抑制 Tat诱导的TJS破坏。在MMP-9基因敲除鼠中Tat诱导的脑微血管毒性、胶质细胞增生和神经元丢失明显较对照组减少。2.罗格列酮可抑制hCMEC/D3及C57BL/6J小鼠脑微血管中Tat诱导的ICAM-1和VCAM-1蛋白/mRNA表达增加，而这种抑制作用可被GW9662和Akt抑制剂KP3721逆转。罗格列酮还可抑制Tat诱导的Akt磷酸化反应。3.脂多糖(LPS)是重要的炎性致病因素，可诱导hCMEC/D3中Occludin 和 ZO-1 蛋白破坏及p38MAPK和JNK 磷酸化水平增高，而抑制p38MAPK 和JNK 磷酸化以及MMP-9 的活性可以明显上调 LPS 诱导的 Occludin的表达，但对 ZO-1表达无明显影响。另外阻断p38MAPK 和JNK通路可显著降低MMP-2/MMP-9 的高表达。4.Tat抑制hCMEC/D3的Occludin 和LRP表达，同时上调RAGE表达。Rho/ROCK通路抑制剂法舒地尔显著抑制Tat诱发的Occludin和LRP1的破坏，同时明显减少RAGE蛋白/mRNA 表达。5.Tat可诱导 Claudin-1、ZO-1和ZO-2蛋白表达下调，而雌二醇可抑制Tat介导 Claudin-1，ZO-1的破坏而对BBB起保护作用。本项目的完成首次阐明MAPKs及MMPs调节Tat诱导BBB破坏的作用机制，进一步研究PPAR激动剂、E2、MMPs及ROCK抑制剂的保护作用，将为HIV-1感染提供新的治疗策略。