一种新型高效单宁酰基水解酶的晶体结构及其催化机制

鞣花单宁的生物毒性和结构复杂性使其成为植物多酚生物降解领域的难题。单宁酰基水解酶是鞣花单宁生物降解的关键酶，其结构功能不明是严重制约植物多酚生物降解理论和应用发展的瓶颈问题之一。本项目以课题组前期研究中发现的一种新型高效鞣花单宁酰基水解酶（Ellagitannin acly hydrolase, EAH）为研究对象，采用已建立的化学修饰方法合成具有典型鞣花单宁结构特征的底物类似物硫酚，将其与EAH反应形成酶-底复合物；基于已建立的EAH晶体的结晶技术获得酶-底复合物晶体，使用本所X-ray仪衍射获取EAH及酶-底复合物的三维分子结构信息，明确酶-底结合位点；通过体外定点突变获得结合位点上编码氨基酸置换的EAH突变体，以确定EAH活性位点，阐明EAH催化机制。本研究不仅对拓宽鞣花单宁这一可再生资源利用具有重要的现实意义，而且对推动植物多酚生物降解理论发展具有重要的科学价值。

鞣花单宁的生物毒性和结构复杂性使其成为植物多酚生物降解领域的难题。单宁酰基水解酶是鞣花单宁生物降解的关键酶。本项目对前期研究中发现的新型高效鞣花单宁酰基水解酶（EAH）进行研究，在本基金的资助下获得如下研究进展：（1）合成了具有典型鞣花单宁结构特征的底物类似物栗木鞣花素、赤芍素及鞣云实素的硫酚，研究显示EAH没能对硫酚发生水解反应，证实了鞣花单宁的酚羟基是影响底物与酶的结合的功能基团，并发现合成的底物类似物硫酚的清除自由基活性提高200倍。（2）EAH经纯化后经β巯基乙醇还原和未经还原的EAH均显示为单一的条带，说明该EAH为单体蛋白，无亚基结构，依据标准蛋白可看出EAH的相对分子量与已经报导过的单宁酶分子量均不一样，这表明EAH是一种新的单宁酶。（3）通过圆二色性光谱及蛋白拟合软件CDNN等手段对EAH二级结构研究发现，其α螺旋结构占14%，反向β折叠占32.4%，β折叠占4.8%，β转角占18.8%，无规则结构占29.9%，单宁酶的Trp残基处在一个疏水的环境中。由二级结构组成比例可知，β结构是结构组成中主要部分。（4）基于已建立的结晶方法获得EAH晶体，使用X-ray仪衍射获取EAH的三维分子结构信息，在2.5埃的分辨率上得到EAH的晶体结构，结果表明EAH是一个球蛋白且具有经典的β/α折叠。（5）通过采用pNIC28-Bsa4载体进行LIC-PCR并将构建好的载体转化BL21-DE3后得到EAH重组子，研究表明重组和野生EAH有类似的酶活性及底物特异性。（6）基于已建立的结晶方法获得酶-底复合物晶体，使用X-ray仪衍射获取的EAH酶-底复合物的三维分子结构信息，得到了EAH酶-底复合物的晶体结构，通过对定点突变获得结合位点上编码氨基酸置换的EAH突变体，突变分析发现位于催化中心入口处的378位芳香族氨基酸侧链在底物结合中起重要作用，EAH的His410和Arg414突变使它对水解鞣花单宁时失活，表明His410和Arg414在特异性水解鞣花单宁过程中起关键作用。由于EAH为本课题特有，国外无此研究。.在本基金的资助下，已发表标注基金号“20972105”的SCI收录论文13篇、EI收录论文1篇及中文核心期刊论文1篇，培养在读博士后1人，培养博士研究生3名，其中毕业2人，在读1人，培养硕士研究生11名，其中毕业6人，在读5人。