马铃薯腐烂茎线虫高效RNAi致死基因的克隆与功能分析

Sweet potato stem nematode disease, that caused by potato rot nematode- Ditylenchus destructor Thorne, is an important disease in Northern China and a seriouse threat to the development of China's potato industry. The application of RNA interference technology in developing transgenic resistant plants provides a new strategy for the control of sweet potato stem nematodes. In present project, the nematode lethal genes will be screened out by analyzing its transcriptome data, and its cDNA sequences will be subsequently cloned and sequenced. In vitro dsRNA soaking method will be used for screening of efficient lethal genes, real time-PCR method will be used to detect the silencing efficiency of target genes and Pluronic F-127 colloid is used to study its effect on the behavior of the nematode. Nematode RNAi system mediated by transgenic dsRNA Botrytis cinerea will be constructed. The real time-PCR method and creterion of nematode reproduction amount are used to evaluate the lethal efficiency of lethal genes. Finally, the temporal expression characteristic of these obtained efficient lethal genes will be studied by real time-PCR and in situ hybridization. The study will lay the foundation for the development of new nematode resistant varieties of sweet potato with expression of the lethal gene dsRNA and provide theoretical support on the development of new control strategies of Ditylenchus destructor.

由马铃薯腐烂茎线虫危害造成的甘薯茎线虫病是我国北方薯区的重要病害，严重威胁着我国甘薯产业的发展。利用RNAi 技术来培育转基因抗线虫品种可为甘薯茎线虫病提供新的防控策略。本项目拟通过分析马铃薯腐烂茎线虫转录组数据，筛选致死基因，并克隆其全长cDNA序列；通过体外dsRNA浸泡法来筛选高效致死基因，用Real tiem-PCR来检测靶基因沉默效率，以Pluronic F-127胶体为介质研究靶基因沉默后对线虫行为学的影响；构建转dsRNA灰葡萄孢介导的马铃薯腐烂茎线虫RNAi技术体系，并通过靶基因表达量以及线虫的繁殖量来评价致死基因的RNAi致死效率，最终获得系列高效致死基因，并利用Real time-PCR和原位杂交技术明确致死基因的时空表达特征。本研究可为研发表达致死基因dsRNA的抗线新品种奠定基础，为开发制定马铃薯腐烂茎线虫的新型防控技术提供理论支撑。

马铃薯腐烂茎线虫（Ditylenchus destructor）引起的甘薯茎线虫病，给我国的甘薯产业生产造成了严重损失。在实际生产中甘薯茎线虫病的防治主要以涕灭威之类的高毒药剂为主，导致农药残留、环境污染以及线虫抗药性的产生。因此，需要开发一种新的线虫控制方法，例如通过dsRNA/siRNA介导的基因沉默（RNAi）来开发抗线虫类作物将具有很好的前景。本项目通过对马铃薯腐烂茎线虫转录组数据进行生物信息学分析，获得了111个马铃薯腐烂茎线虫的潜在致死基因。首次克隆获得了马铃薯腐烂茎线虫mel-26和unc-87基因的全长cDNA，并对克隆片段序列进行了分析。Southern杂交结果显示mel-26和unc-87基因在茎线虫基因组中均为单拷贝，可能属于持家基因。in vitro RNAi结果显示受mel-26、 unc-87以及hsp70-f三个基因dsRNA处理的线虫靶基因表达量均显著降低；生物学测试结果显示受unc-87 dsRNA处理线虫的迁移能力影响不显著，而受mel-26 和hsp70-f dsRNA处理的线虫迁移力影响显著，前者迁移力明显加强，而后者则明显减弱；受unc-87 和hsp70-f dsRNA处理线虫的繁殖力显著下降，而受mel-26 dsRNA处理的线虫繁殖力则显著提高，说明mel-26基因可能在线虫的迁移和繁殖中发挥着负调控的作用；unc-87基因可能在线虫迁移中的作用不明显，而在线虫的繁殖中发挥着正调控作用；hsp70-f基因在线虫的迁移和繁殖中均具有一定的正调控作用。逆境处理结果显示茎线虫在干燥和高温胁迫下hsp70-f基因的表达受影响较大呈S型波动，而在低温胁迫下该基因的表达仅在初期有所下调，之后又恢复至原始状态。构建了转unc-87基因dsRNA的灰葡萄孢饲喂体系，通过饲喂茎线虫发现1-804和2-602号转化子的线虫繁殖量显著降低，说明unc-87转化子灰葡萄孢具有一定的降低线虫繁殖力的作用。另外，还构建了in planta RNAi体系，为下一步培育抗线品种提供技术储备。本项目为进一步筛选马铃薯腐烂茎线虫高效致死基因，进而开展甘薯抗线虫基因工程研究奠定基础。