根结线虫高效RNAi靶标基因的挖掘与聚合致死效应研究

本项目以线虫基因组学为基础，在模式秀丽隐杆线虫RNAi比较功能基因组信息分析的基础上，从基因组水平上搜索表现致死效应的基因为候选靶标，并利用TRV-VICS载体技术在烟草上快速验证候选基因的抗线虫功能，并且同时沉默两个或多个基因，验证其多个基因同时沉默后的抗线虫效果。将验证的抗线虫效果最好的2个RNAi致死基因克隆到表达dsRNA的双启动子驱动根部特异高效表达双元载体中，同时转化黄后获得转基因植株，通过根部接种南方根结线虫后测定RNAi致死基因dsRNA根表达对线虫侵染、发育和繁殖的影响，并以转化单一基因作为参照，最终获得聚合致死效应的转基因黄瓜。

根结线虫病是黄瓜的重要病害，培育抗线虫品种是控制线虫危害的最佳途径。本研究利用比较功能基因组学，从模式线虫中筛选得到具有RNAi致死效应的候选基因，克隆得到南方根结线虫的30个同源基因，并利用TRV-VIGS技术验证了30个靶标基因的抗线虫功能，筛选得到抗线虫效果最好的5个基因（Asb、Col125、 F49c12 、F36a2、Mapk）。通过双基因共侵染，筛选得到抗线虫效果最好的Asb和Mapk组合。本研究以黄瓜子叶为遗传转化外植体，经过不断的摸索和实验，建立了一套高效的黄瓜遗传转化体系，利用农杆菌转化及基于pCAGC1341的植物表达载体的RNAi技术将Asb和Mapk分别转化黄瓜，成功获得表达目的基因dsRNA的转基因黄瓜植株。通过盆栽实验确定，表达Mapk的转基因黄瓜对根结线虫具有明显的抗性，同时种植转基因黄瓜于根结线虫危害严重的保护地，表明转基因黄瓜抗性明显，同时通过对土壤中细菌，真菌，古菌和线虫的多样性研究，证明了转基因黄瓜未对根际土壤微生物群落产生明显影响，具有一定的安全性。此外，将Asbi叠加转化至表达Mapk的黄瓜中，获得双抗的转基因黄瓜，结果表明表达双基因的转基因黄瓜其对根结线虫的抗性高于表达单一基因的转基因黄瓜。本研究创建了表达线虫双基因和单基因dsRNA的黄瓜，为黄瓜从分子育种的遗传操作提出重要依据和技术途径。