转座子介导斑马鱼精子插入突变体库构建及超级增强子分离鉴定

Super enhancer is a new type of gene regulatory element discovered recently, it can decide the attribute and fate of cells, and regulates cell growth and differentiation through the regulation of key genes. Studies have shown that super enhancer is closely related to a variety of human diseases, and participate in the regulation of a variety of cancers through a unique way. Therefore, super enhancer research has important academic value and application prospect in medicine, but the current study on super enhancer mainly stays at the cellular level. Based on the previous research, this project intends to use transposon mediated technique to construct sperm insertion mutagenesis library in zebrafish; then to isolate and identify the super enhancers in zebrafish cells and tissues. Then the CRISPR / cas9 genome modification technology will be used to knockout the core component of typical super enhancer to investigate the function of super enhancer in embryo and in vivo levels. This project aims to mine super enhancer in zebrafish and conduct the functional analysis of super enhancer in embryo and individual level at first time, which will set up the research basic for the future global annotation of the super enhancer directory in zebrafish cells and tissues, and understanding of the molecular mechanisms of super enhancer in regulation of cell and embryo development. And these results will provide the reference for the application research of super enhancer in human medicine. This study is planning to apply for 1-2 patents, publish 2-4 high IF SCI papers, and train 2-3 core researchers, and 3-5 graduate students.

超级增强子是新发现的一类新型基因调控元件，它能够通过调控关键基因，决定细胞的属性和命运，调节生长分化。研究表明超级增强子与人类多种重要疾病密切相关，并通过特有的方式参与多种癌症的调控，具有重要的学术研究价值和医学应用前景，但目前对超级增强子的研究主要停留在细胞水平。本研究结合前期研究基础，拟利用转座子介导技术，构建斑马鱼精子插入突变体库，进行斑马鱼超级增强子分离鉴定，获取斑马鱼超级增强子基础数据，并利用CRISPR/Cas9基因组修饰技术进行典型超级增强子核心元件敲除，在胚胎和活体水平开展超级增强子功能研究。项目拟率先尝试在斑马鱼胚胎和个体水平进行超级增强子挖掘和功能解析研究，为将来整体解析斑马鱼细胞和组织超级增强子蓝图目录，深入揭示其对生长发育调控的分子机制奠定基础，并为其在人类医学中的应用研究提供参考。拟申请专利1-2项，发表SCI论文2-4篇，培养研究生3-5人，研究骨干2-3人。

超级增强子是最近发现的一类新型基因调控元件，它能够通过调控关键基因，决定细胞的.属性和命运，调节生长分化。研究表明超级增强子与人类多种重要疾病密切相关，并通过特有的方式参与多种癌症的调控，具有重要的学术研究价值和医学应用前景，但目前对超级增强子的研究主要停留在细胞水平。本研究挖掘出具有自主知识产权的高活性ZB转座子，在正常细胞转染剂量下，ZB转座活性显著高于SB、PB和Tol2。将ZB与SB、PB和Tol2应用于增强子捕获研究，结果表明，ZB在斑马鱼上增强子捕获效率与Tol2相近（约56%），显著高于SB和PB。通过转座子介导，共获得约150个斑马鱼增强子捕获系，已成功注解了11个品系，获得15个潜在的增强子和重要功能基因（如大肿瘤抑制因子LATS1）的上下游调控元件，大部分增强子具有转录活性，少数还具有组蛋白修饰标记(H3K4me1)，此为超级增强子特征，但还需进一步实验验证。本研究高效制备了ZB转座子和转座酶的双转基因公鼠4只，从135个后代小鼠中获得72只ZB转座子转基因阳性鼠，其中61只插入位点与父本的转座子插入位点一致，11只插入到了新位点，重新转座效率为15.3%（11/72），高于SB和PB（约10%）。建立了3个具有GFP特异表型的小鼠增强子捕获品系，已获得11个潜在的增强子，且增强子信号较强。本研究构建并优化了可用于斑马鱼增强子和哺乳动物增强子活性验证的系列载体，这些载体可有效检测增强子在斑马鱼体内或哺乳动物细胞系的表达调控功能，并揭示了增强子与不同启动子存在互作效应差异性，验证了增强子具有基因表达调控组织特异性，为进一步研究增强子的调控机制奠定基础。本项目在胚胎和个体水平进行增强子和超级增强子的挖掘和功能解析研究，所捕获的调控元件具有增强子及超级增强子特征，为将来整体解析斑马鱼细胞和组织超级增强子蓝图目录，深入揭示其对生长发育调控的分子机制奠定基础，并为挖掘超级增强子提供研究方法。