HBV感染中HBcAg下调CD59促进MAC介导的肝损伤机制研究

HBV感染引起的肝损伤主要由免疫系统介导，但机制尚未完全阐明。现有研究主要集中在T 细胞介导的肝脏免疫损伤机制上，而对于补体系统的作用研究很少。我们前期研究发现在肝细胞中HBcAg能导致补体调控蛋白CD59在mRNA和蛋白水平上明显下调,同时在HBV感染重症患者肝组织切片中检测到大量MAC沉积。故推测HBcAg致CD59下调可能通过促进MAC介导的攻膜效应，导致肝细胞溶解性坏死，释放DAMPs，招募炎症细胞，进而加重肝损伤。基于此，我们拟首先分析临床HBV感染患者肝穿样本中HBcAg、CD59、MAC、炎症细胞数量与肝脏病理损伤的相关性，再通过蜕皮激素诱导系统探讨HBcAg的可控性表达致CD59下调与MAC溶细胞作用的量效关系，然后利用分子生物学方法研究HBcAg致CD59下调的分子机制。期望进一步阐明HBV 感染的免疫病理损伤机制，并可能为控制该免疫损伤过程提供一个新的干预靶点。

按照项目的整体研究计划和目标，我们构建了pMSCV-HBc质粒并建立了稳定表达HBc的细胞系，利用串联亲和纯化和质谱，我们获得了HBc的相互作用蛋白CD59，通过免疫共沉淀，我们验证了这种在细胞内的相互作用。流式、定量PCR和免疫印迹实验均证实在表达HBc的HepG2细胞中， CD59的表达在mRNA和蛋白质水平上均下调了。为了验证CD59的下调对细胞的影响，我们完成了致敏实验，结果证实CD59的下调能促进补体的攻击。为了验证乙肝病人中也存在这种机制，我们收集了51例慢性乙肝病人和10例健康个体，通过免疫组化和定量PCR分析HBc和CD59在肝炎病人中的表达及其与补体蛋白的相关性，结果表明HBc、CD59和补体蛋白与肝炎病人肝脏的损伤存在相关性。为了搞清楚CD59下调的机制，我们使用激光共聚焦观察了HBc和CD59在HepG2细胞中的表达分布，结果显示在表达HBc的肝细胞中，CD59进入了细胞核中，并且HBc和CD59发生了共聚现象。CD59可能是被HBc劫持进入了细胞核中，那么CD59的表达下调是HBc作用还是CD59的自身反馈作用，我们在CD59序列的前面设计了一段核定位序列，在不需要HBc的情况下，CD59能自行进入细胞核，通过流式和激光共聚焦，我们发现了CD59可能通过自身反馈的机制导致其表达下调的。至此，我们顺利完成了本项目预定的研究计划和目标。