胞内化抗体介导的HBcAg去功能化抑制HBV核壳体形成的机制研究

核心抗原（HBcAg）是乙型肝炎病毒(HBV)核壳体的唯一包被蛋白。HBV的复制依赖于胞浆内的HBcAg包被HBV前基因组形成病毒核壳体。如通过核心抗体（HBcAb）与HBcAg结合，阻断其包被HBV 前基因组，敲除HBcAg的功能则可抑制HBV的复制。但是，由于抗体不能通过细胞膜进入细胞内，如何实现抗体胞内化是亟待解决的重要临床课题。我们的前期研究提示：新型细胞穿透肽（CTP）可携带外源性蛋白穿透细胞膜靶向定位于肝细胞胞浆，为实现抗体胞内化提供了依据。本研究拟通过多种手段将抗HBcAg单链抗体(antiHBcAg scFv)导入HBV感染的肝细胞，实现抗HBcAg单链抗体的胞内化，通过高度特异的抗原抗体结合反应敲除HBcAg的功能，阻断HBV病毒颗粒的包装，探索新的抗HBV药物靶点，为有效治疗HBV感染提供新思路。

乙型肝炎病毒（HBV）感染是严峻的公共卫生问题，但是，目前临床尚无满意的抗HBV药物，探索新的抑制HBV复制的方法有广阔的临床应用前景。本课题通过构建表达细胞穿透肽(CTP)与抗HBcAg单链抗体（antiHBcAg scFv）的融合蛋白的质粒，探讨了CTP-antiHBcAg scFv融合蛋白在HBV复制过程中的效应和作用机制。首先，我们利用前期实验获得的HBcAg单链抗体基因，构建表达CTP-antiHBcAg scFv融合蛋白的原核表达质粒表达目的蛋白，纯化鉴定后ELISA法检测显示其抗体结合活性高、抗原特异性好、细胞毒性小。随后，我们用CTP-antiHBcAg scFv蛋白干预HepG2.2.15细胞，细胞免疫荧光检测证实CTP能高效介导antiHBcAg scFv进入细胞且定位在胞浆；而且，荧光定量PCR法检测显示CTP-antiHBcAg scFv蛋白能以剂量依赖方式抑制HepG2.2.15细胞上清中HBV DNA拷贝数；Southern blot和Western blot分析提示CTP-antiHBcAg scFv蛋白通过抑制HBV 复制中间体和核壳体的形成来抑制HBV的复制。而腺病毒载体介导的antiHBcAg scFv则不能抑制HBV的复制。本研究通过靶向阻断HBV核壳体形成和病毒颗粒包装来抑制HBV复制，证实研发以病毒包装过程为靶点的抗病毒药物是治疗慢性HBV感染的新途径。