CsERF004调控黄瓜双抗性分子机制的研究

We screened out the cucumber resistance-related gene CsERF004, a gene encoding ERF transcription factor，using transcriptome sequencing under Corynespora cassiicola and Pseudoperonospora cubensis stress. Over-expression of CsERF004 could enhance the resistance of cucumber to downy mildew and target spot. In order to investigate the regulatory mechanism of CsERF004 in cucumber double-disease resistance, we will analyze the downstream regulatory genes of CsERF004 in this study. Transgenic plants and wild-type plants will be sequenced to analyze the gene expression changes at transcriptome level. Chromatin immunoprecipitation sequencing would be used to study the DNA binding target of CsERF004. Combining with the changes of the microscopic phenotype of the transgenic plants，the key target genes will be screened out in the consistent results of RNA-seq and ChIP-seq. The function of the target genes would be used to verify by the qPCR and gene silencing techniques. The analysis of the transcriptional regulatory network of CsERF004 can lay the foundation for further study on molecular mechanism of double diseases resistance in cucumber, so as to provide a theoretical basis for multi-resistant cucumber varieties.

本课题组通过对霜霉病菌和棒孢叶斑病菌胁迫下的黄瓜叶片进行转录组测序，已筛选获得编码ERF转录因子的基因CsERF004，并明确了过表达CsERF004能够提高黄瓜对霜霉病及棒孢叶斑病的抗性。为了探明CsERF004在黄瓜双抗性中的调控机制，本研究将进行CsERF004下游调控基因的分析。通过对转基因植株和野生型进行转录组测序，分析在转录组水平的基因表达变化；利用染色质免疫共沉淀测序技术研究CsERF004的DNA结合靶标。将RNA-seq和ChIP-seq结果重叠并结合转基因植株的显微水平表型的变化筛选关键靶基因。利用qPCR及基因沉默等技术对筛选到的靶基因进行功能验证。综合分析CsERF004的调控网络，为深入研究黄瓜双抗性分子机制奠定基础，进而为培育黄瓜多抗性品种提供理论依据。

目前，黄瓜霜霉病和棒孢叶斑病是黄瓜生产上的重要病害。病害传播流行速度快，对黄瓜生产威胁极大。单一抗病品种已无法满足生产需求，多抗性品种又极为缺乏，因此培育多抗性品种尤为重要。前期基础中已经通过对霜霉病菌和棒孢叶斑病菌胁迫下的黄瓜叶片进行转录组测序，已筛选获得编码ERF转录因子的基因CsERF004，并明确了过表达CsERF004能够提高黄瓜对霜霉病及棒孢叶斑病的抗性。本项目通过转录组测序和酵母双杂交文库互作蛋白筛选挖掘CsERF004潜在下游基因，同时对潜在上游基因进行了功能验证，初步探索了CsERF004在黄瓜双抗性中的调控网络，研究结果将为解析黄瓜双抗性分子机制奠定基础，同时也将加快黄瓜分子育种的脚步。.主要结果如下：.(1)成功克隆了CsSTK。通过PEG介导的拟南芥原生质体瞬时表达和农杆菌介导的烟草瞬时表达，亚细胞定位结果表明CsSTK定位在细胞膜上。成功获得过表达CsSTK转基因植株。表型接种鉴定表明过表达CsSTK转基因植株能够增强黄瓜对棒孢叶斑病和霜霉病的抗性。过表达CsSTK后会使CsERF004显著上调表达，酵母双杂交验证显示CsSTK与CsERF004存在互作，推测CsSTK可能是CsERF004的上游基因。.(2)通过转录组技术对转基因CsERF004植株、野生型植株及病原菌胁迫的转基因CsERF004植株进行转录组测序，筛选到31个与抗病相关的基因。.(3)为了进一步筛选下游调控基因，构建了病原菌胁迫下黄瓜酵母双杂交cDNA文库并进行了互作蛋白的筛选。筛选到潜在下游基因3个，7号、8号和25号。CsERF004与潜在下游基因一对一酵母双杂交验证，结果发现7号、8号、25号与CsERF004均存在互作。.(4)25号蛋白为几丁质酶，属于GH18家族蛋白。表达模式分析表明，CsGH18积极响应黄瓜棒孢叶斑病菌和霜霉病菌的胁迫。转基因CsERF004植株中CsGH18显著上调表达。转基因CsSTK植株中CsERF004和CsGH18均显著上调表达。同时CsSTK、CsGH18与CsERF004酵母双杂交结果显示均与CsERF004互作。初步推测在黄瓜抗病机制中CsERF004可能调控CsGH18增强黄瓜抗病性。