蝙蝠耳蜗毛细胞再生基因分析鉴定及应用研究

20多年的研究证明，鸟类耳蜗毛细胞具有再生能力，而哺乳类耳蜗损害的毛细胞不能再生。经我们十多年的反复实验探索，终于找到哺乳类耳蜗毛细胞再生的动物模型，发现回声定位蝙蝠耳蜗毛细胞受损后支持细胞转分化为再生的毛细胞，这种再生毛细胞具有正常毛细胞的表型和听觉功能。我们拟继续深入探讨蝙蝠耳蜗毛细胞再生的分子机制，包括为何它的支持细胞能够在毛细胞损害时启动进入细胞增殖分化的细胞循环，以及启动支持细胞进入细胞增殖分化的内源性细胞因子或基因因子。我们拟进行差异表达基因分离这种蝙蝠毛细胞再生的基因因子，进行克隆纯化后，构建重组腺病毒载体，用基因治疗方法将蝙蝠耳蜗毛细胞再生基因因子导入受损的哺乳类耳蜗，建立促进哺乳类耳蜗受损毛细胞再生的方法。本研究在哺乳类耳蜗毛细胞再生领域实现重大突破，相关分子基因及机制研究可为耳聋治疗领域开辟新的途径，可为人类神经性耳聋的治疗提供重要的理论基础和技术方法帮助。

耳蜗毛细胞再生是感音神经性聋治疗的热点和关键课题，我们从鸟类到哺乳类动物研究耳蜗毛细胞再生已经20多年。我们挖掘祖国医学宝库，选用中医药治疗感音神经性耳聋动物，研究观察了纯中药制剂对庆大霉素致聋、工业噪声致聋，以及中药拮抗治疗对豚鼠耳蜗损伤毛细胞的修复再生作用。通过实验前后不同恢复时间的听功能测定和组织形态超微结构观察，发现在听功能逐渐恢复的同时，耳蜗Corti器损害区的支持细胞增殖分化，表现为毛细胞损害消失处的支持细胞表皮板扩大、微绒毛密度增加并长长，逐渐转分化为新生的毛细胞，使耳蜗组织结构恢复正常。我们从听功能分析到形态结构观察，系统完整的观察到中药促进耳蜗损害毛细胞的修复再生过程，这是对中药促进耳蜗毛细胞再生的充分证明，对开发中药治疗感音神经性耳聋具有重要的科学意义和广阔的应用前景。为了发挥中西医各自的优势，我们继续探索了感音神经性耳聋动物在中药治疗的同时，应用靶向性Notch信号抑制剂导入耳蜗，观察到对促进耳蜗损害毛细胞修复再生有较强作用。已证明老年性耳聋是环境和遗传因素共同造成的，而老年性聋的遗传基因鉴定和分析及其病理机制研究十分缺乏。我们在应用遗传缺陷纯种系小鼠进行了系列研究。RT-PCR测定cdh23在Cdh23nmf308/nmf308小鼠的突变，遗传分析起绘制出特异的突变位点，畸变产物耳声发射(DPOAE)测定和脑干诱发反应(ABR)阈值分析评估AHL，耳蜗组织病理用扫描电镜和透射电镜观察，碘化丙啶 (PI)细胞核标记，TUNEL标记凋亡细胞，测定Caspase-3的活性。遗传图谱鉴定AHL小鼠Cdh23 nmf308/nmf308连锁分析。与B6(+/+)基因性小鼠筛查比较同一突变在外显子(63T>C) 基因序列。Cdh23nmf308/nmf308小鼠1月龄有5-10%，而3月龄有100%的耳蜗底回外毛细胞减少。从1月龄始，DPOAE幅值降低和ABR阈值在高频(16KHz)升高。形态学和细胞分析显示Cdh23nmf308/nmf308小鼠耳蜗外毛细胞凋亡的形态改变时程。我们的研究结果证明cdh23突变将妨害到静纤毛顶连接导致毛细胞凋亡，造成相同cdh23突变的人类发生老年性聋(Petit et al,.2001; Zheng et al,.2005)， Cdh23nmf308/nmf308小鼠是研究老年性聋的理想动物模型。发现了老年性聋的机制。