OPG蛋白突变体的制备及其对骨质疏松防治效果的研究

OPG蛋白是骨代谢中心调节系统RANKL-RANK-OPG的重要成员，在骨吸收和形成过程中发挥关键作用。一些科研机构曾将OPG作为重点研发对象，使其一度成为抗骨质疏松的"明星"蛋白。但研究中发现OPG存在两大缺陷，1.OPG与其配体（RANKL）亲合力较弱, 高浓度才起效；2.OPG可与TRAIL（一种肿瘤抑制因子）结合，增加肿瘤发生的可能性。这限制了OPG的临床应用。本研究组在前期实验中首次成功解析了RANKL/RANK结构，分析和验证了RANKL/RANK相互结合的关键氨基酸位点，并测定了RANKL-RANK之间的亲和常数。在此工作基础上，拟通过计算机辅助同源模建和基因突变等技术，改造OPG分子中与RANKL和TRAIL结合关键氨基酸位点，获得一种既与RANKL具有更高亲和力且与TRAIL具有更低亲和力的新型OPG突变体，并通过细胞、动物实验检验其防治骨质疏松的效果。

OPG蛋白是骨代谢中心调节系统RANKL-RANK-OPG的重要成员，在骨吸收和形成过程中发挥关键作用。许多科研机构在研究中发现OPG蛋白存在与配体RANKL亲和力较弱、能结合肿瘤抑制因子TRAIL并干扰其抗肿瘤作用两大缺点。课题组在前期工作中分析了RANKL/RANK结合关键位点，在此基础上通过基因突变技术，改造了OPG分子中与RANKL和TRAIL结合关键氨基酸位点，构建了8种预计与RANKL结合力增加、11种预计与TRAIL结合力下降的共计19种OPG突变体基因。将突变基因导入原核载体，构建了OPG的大肠杆菌表达质粒pET28-SRT-OPG，在大肠杆菌系统使用包涵体变复性法大量表达了OPG蛋白突变体并加以纯化。采用Biacore检测技术测定了RANKL/TRAIL与野生型OPG的亲和力，OPG与RANKL的结合常数为6.5e-9M，亲和力低于RANK与RANKL之间的亲和力 1.1e-10M，而高于OPG与TRAIL之间的结合常数7.0e-8M。细胞实验方面，TRAP染色实验和分化定量分析实验证明了野生型OPG对于RANKL诱导RAW264.7细胞生成破骨细胞的抑制作用呈剂量效应。Sub-G1（凋亡细胞）的FACS分析技术，发现野生型OPG抑制了TRAIL诱导的Colo205细胞凋亡，且抑制作用呈剂量效应。由于蛋白制备方法改进耗时较长、Biacore检测中各种原因导致多次更换芯片和拟合方式；故突变体的Biacore检测仅部分完成，突变体细胞实验、动物实验还有待继续完成。以上研究为下一步筛选目的OPG突变体、研制对TRAIL抗肿瘤能力影响小的抗骨质疏松OPG蛋白药物打下基础。