结核杆菌抗原ESAT-6特异性CD8+T细胞免疫保护作用研究

By recently,It has been more clearly demonstrated that CD8+T cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are essential to the control of Mycobacterium tuberculosis (Mtb)infection. Its exact effective mechanism still need to be intensively investigated.The early secreted antigenic target 6 (ESAT-6),a kind of causative factor from virulent M. tuberculosis,is a highly immunogenic target of the cellular immune response to tuberculosis.Identification of ESAT-6 specific CD8+ T-cell epitopes will bring advantages for studies of many aspects of the CTLs response to Mtb.HLA transgenic mice is newly emerged and powful tool to inditify antigenic epitopes of T cells in vivo. In this study,we set out to define the CD8+T cell epitopes of ESAT-6 by both in vitro and in HLA-A*0201 transgenic mice.Through generated tetramers staining , enzyme-linked immunosorbent assay,and CTL assay to evaluate their ability to provoke an in vivo and in vitro peptide-specific CTL response in HLA-A*0201 transgenic mice and also in peripheral blood lymphocytes(PBLs) of HLA-matched healthy donors.In established mouse model infected with Mtb to further reveal the prophylactic and therapeutic effects of petide-specific CTLs.Demonstration of the above-described epitopes of ESAT-6 and its CTLs activity is likely to represent promising subunits for future vaccine design against human tuberculosis,especially for treatment of drug resistant tuberculosis.

愈来愈多的证据表明CD8+T 细胞在结核病中发挥着不可忽视的免疫保护作用，其确切机制亟待深入阐明，早期分泌蛋白ESAT-6为致病结核杆菌特有致病因子，诱导强烈的T细胞应答，业已成为结核病一个焦点靶抗原。选择ESAT-6特异性CTLs进行免疫保护性研究，首先要确定ESAT-6特异性CTLs表位，HLA转基因鼠为体内研究抗原表位提供了有力工具，本课题将利用HLA-A*0201转基因鼠、并结合体外实验明确这一关键抗原的CTLs表位，通过制备tetramer试剂，实现ESAT-6特异性CD8+T细胞监测，研究表位特异性CTLs细胞IFN-r分泌、对感染巨噬细胞特异性细胞毒活性以及诱导健康人特异性CTLs产生的潜能。并在感染动物模型，揭示表位特异性CTLs对致病结核杆菌感染的实际防治效果。以期为结核病CD8+T细胞功能状态评估（包括疫苗效果评估），针对耐药性结核病发展多机制、多表位疫苗奠定理论基础。

“结核杆菌抗原ESAT6特异性CD8+T细胞免疫保护作用研究”为一年期限面上项目。旨在结合体外实验，通过转基因鼠明确我国优势的HLA-*0201单倍型人群ESAT-6特异性CD8+T细胞表位，在解决这一关键问题基础上，研究ESAT-6表位特异性CD8+T细胞介导的抗感染效应和机制。本研究将有助阐述CD8+T细胞的抗结核作用，具有理论探索性，对于结核病tetramer辅助诊断、评估CTLs功能状态也是一项奠基性工作，对耐药结核感染的疫苗治疗研究，如联合CD8+T细胞偏移型新型佐剂CD137（4-1BB）激动剂是一种全新尝试。.本课题的主要任务是，确定ESAT-6特异性CTLs表位，HLA转基因鼠为体内研究抗原表位提供了有力工具，本课题将利用HLA-A*0201转基因鼠、并结合体外实验明确这一关键抗原的CTLs表位，通过制备tetramer试剂，实现ESAT-6特异性CD8+T细胞监测，研究表位特异性CTLs细胞IFN-r分泌、对感染巨噬细胞特异性细胞毒活性以及诱导健康人特异性CTLs产生的潜能。并在动物模型，揭示表位特异性CTLs对致病结核杆菌感染的实际免疫效果。 .本课题在前期积累和课题实施的1年来如期完成了课题预定任务，具体情况概述为：①体内外实验明确了2个ESAT-6 表位肽（在HLA-A*0201单倍型结核病人），均为9肽序列。② 分别构建含有HLA2BSP(含有15个可供识别生物素化的氨基酸位点)和β2微球蛋白(β2m)基因的原核表达载体,并进行表达、复性、鉴定及纯化。再分别将筛选出的特异性短肽与HLA2 BSP和β2m蛋白在体外进行耦合,该复合物经纯化浓缩后进行生物素化。生物素化的产物经纯化浓缩后形成单体,此单体再与藻红蛋白标记的链霉亲和素按一定比例耦合构建成四聚体。③ 实现了结核病人ESAT-8特异性CD8+T细胞的有效tetramer检测，其频率占CD8+T细胞的0.03-0.09%。④ 抗原九肽负荷的抗原递呈细胞(APC) ,刺激正常HLA2患者的外周血单个核细胞(PBMC)，培养2-3周，四聚体和CD8+T双阳性的肽特异性CTL数量增值15%以上，表明抗原肽有良好的免疫原性和特异性。⑤ 免疫佐剂抗人CD137 或人CD137陪体（多聚体），具有明显的免疫辅助刺激ESAT-6特异性CD8+T细胞增殖和IFN-r释放作用。