具有光交联和蛋白“质谱标签”转化功能的寡糖探针构建及其在"糖链-活体膜蛋白"相互作用研究中的应用

Detection and characterization of oligosaccharide ligands of membrane protein receptors in living cells have been very challenging in glycobiology and cell biology. there is still no an effective method. To address this, we will develop a novel oligosaccharide probe, based on the recent success in the neoglycolipid (NGL) and its enrichment method developed in the recent NSFC funded project. The proposal will be centred on the key issue that the affinity of the carbohydrate-protein interaction is very weak and therefore it is difficult to separate and enrich the “carbohydrate-protein” complex for characterization. Our plan is to use the well documented recognition system beta1,3-glucooligosaccharides-13 mer binding to Dectin-1 as a model to develope a novel NGL probe using beta1,3-glucooligosaccharides-13 mer NGL conjugated to photocrosslinker NHS-SS-Diazirine, to realize the glucan oligosaccharide NGL probe co-valently linking to Dectin-1 protein, effectively solving the problem of isolating the complex. Dithiothreitol is then used to break the “-SS-” bond. The resulting “S-Diazirine" group conjugated in Dectin-1 can be used as a unique mass-tag for mass spectrometry. High sensitivity and high throughput identification of the tagged peptide by MALDI-MS/MS combined with Mascot software will achieve peptide sequencing analysis and protein identification. Finally, the THP-1 cell line expressing Dectin-1 is treated and verified with the probes and technology developed in this work.

在活体条件下开展糖链膜蛋白受体的寻找与鉴定研究极具挑战性，至今尚无有效的方法。本课题拟以申请人在执行青年基金中建立的新型糖脂探针及其富集技术为基础，针对活体条件下由于“糖链—蛋白复合体”作用力极其微弱造成糖链—蛋白复合体难于分离和鉴定的问题，利用已确立的b1,3-葡寡糖十三糖与Dectin-1蛋白特异识别，通过葡寡糖糖脂探针与NHS-SS-Diazirine反应实现双吖丙啶和二硫键基团的引入，双吖丙啶通过与Dectin-1光交联，有效解决 “糖链-蛋白”在分离中的“脱离”难题；通过用二硫苏糖醇来打断“糖链-Dectin-1”交联臂上的二硫键，实现糖脂探针上的“S-Diazirine”在蛋白上的“质谱标签” 转化；然后结合MALDI-MS/MS分析和Mascot软件实现S-Diazirine标记Dectin-1蛋白的高灵敏、高通量鉴定；最后再在表达Dectin-1的THP-1细胞株上进行验证

在活体细胞水平寻找到糖链的配体膜蛋白是阐明糖链功能的基础。目前缺少有效的方法。本项目从糖链的合成，均一糖链的高效分离，具有光交联和质谱标签转化功能的糖链探针的设计与合成，质谱标签转化后巯基肽的特异富集材料和技术开发，双功能糖链探针的活体细胞、组织投递技术建立，在动物模型上的双功能糖链探针投递进行研究，具体研究内容如下：首先建立了包含beta1,3-葡聚寡糖在内的唾液酸基乳糖和环形1,2-葡聚糖的工程菌株耦合发酵高效合成方法，从一锅酶法和多细菌耦合催化策略，建立了beta1,3-葡聚寡糖克级发酵合成的技术与体系，并实现了唾液酸基乳糖的规模化合成；然后基于氯代（F带）黄酸化苯胺衍生的混合寡糖HPLC纯化技术开发研究，本项目研究了4-氯苯胺-3-磺酸和2-氯苯胺-5-磺酸对寡糖进行衍生化的条件，使得反应转化率达到85%；此外，合成和优化了用于项目中质谱标签转化后形成的巯基寡肽特异富集的材料和富集技术，如何实现巯基寡肽的无损吸附/解吸附一直是巯基寡肽分析领域的难点，本研究以壳聚糖(CTS)为原料通过3-甲酰基苯硼酸与壳聚糖上氨基反应合成甲酰基苯硼酸-壳聚糖（CTS-PBS），并在碱性条件下利用氯乙酸和壳聚糖反应从而制得具有pH响应性能力的O-羧甲基壳聚糖-甲酰基苯硼酸(O-CMC-PBS)，通过引入(2，5-二甲氧基-2，5-二氢呋喃-2-基)乙酸甲酯（5MP）基团，从而制得了基于pH响应具有无损富集巯基寡肽的壳聚糖衍生物富集材料O-CMC-PBS-5MP，所富集出的巯基肽直接可以进行LC-MS/MS分析；并且建立了用于携带寡糖和光交联/质谱标签转化功能基团的脂质载体Fmoc- Boc-AOPE合成与纯化技术体系；最后，在细胞和模型动物水平，建立了基于磁性定位和光辐照驱动释放的药物分子（探针）细胞外（内）投递平台与光激活技术体系。研究建立的技术体系我精确确定糖链的配体膜蛋白提供了技术基础。