基于量子点/NBD荧光比率的高灵敏、高通量功能寡糖筛选和构效关系评估体系构建及其应用

Achieving high-throughput screening of the functional oligosaccharides and assessment of their structure-activity relationship are the most important and difficult in the oligosaccharides industry. There is still no effective method to address these problems. In this proposal, a high-throughput analysis of oligosaccharides- protein relationship by the proposed glycolipid sugar chips was used to solve this dilemma. Since the amount of the oligosaccharides on the chip cannot be determined and the sensitivity of AlexFluo 647 towards a target protein is low, we introduce the chemical NBD fluorescent label to the oligosaccharide probes from gluco-oligosaccharides library and CR3 target protein. A soft determination was achieved through fluorescence intensity assay. Due to 100 times higher sensitivity than AlexFluo 647, quantum dots are used to achieve a better detection of the CR3 target protein. Finally, a system for high sensitivity and high-throughput screening of functional oligosaccharides and structure-activity relationship evaluation was established through analyzing the ratio of quantum dot and NBD fluorescence intensity. In addition, the structure-activity relation between CR3 and gluco-oligosaccharides was assessed. This study will play an important role in accelerating the screening and development of functional oligosaccharides and enhancing the level of R&D in China in the field of functional oligosaccharides.

如何实现功能寡糖的高通量筛选及构效关系评估一直是整个寡糖产业链的核心和难题，目前尚无有效方法。为解决该问题，本课题拟以申请人已掌握的高通量分析"糖- 蛋白"作用关系的拟糖脂糖芯片体系为基础，针对目前因无法实现芯片上糖探针的实时测定以及AF647 做为靶蛋白检测标记时灵敏度相对较低，而使得糖芯片尚不能用于"糖-蛋白"构效关系评估的缺陷，利用已有的葡聚寡糖库和CR3 靶标蛋白，首先将灵敏的NBD荧光标记引入到葡聚寡糖探针，通过分析荧光强度实现芯片上寡糖探针的软测定；然后用检测灵敏度比AF647 高100 倍的量子点作为检测标记来实现CR3 蛋白的高灵敏实时检测；最后通过分析量子点/NBD 荧光值比率从而建立高灵敏、高通量的功能寡糖筛选和构效关系评估体系，同时实现CR3 与葡聚寡糖之间的构效关系评估。本研究对加快我国功能糖的筛选与开发、提升我国在功能寡糖领域的研发水平将起重要促进作用。

功能寡糖已经成为全球特膳食品产业中的一个新的重要功能因子。但是寡糖构效关系的不明已令功能糖的研究进入瓶颈阶段，因此如何有效的实现功能寡糖的高通量筛选与构效关系评估已经成为为整个寡糖链产业的核心与重点。针对该问题，本研究项目紧紧围绕寡糖的结构和功能关系开展工作: (1) 建立基于ESI-CID-MSMS的技术体系用于葡聚寡糖的结构解析的技术与方法；（2）以从天然源微生物多糖为糖原,获得聚合度不同的寡糖，通过MALDI-MS和ESI-CID-MS/MS获得序列清晰的寡糖探针；（3）基于糖芯片技术进行葡聚寡糖与DC-SIGN,DC-SIGNR以及MBP蛋白之间构效关系分析，并在AO-NGLs技术体系的基础上开发出NGLs上带有标记的新型荧光探针合成体系，并将该技术体系用于分离纯化所获得的寡糖的衍生化，然后用量子点标记蛋白来检测实现寡糖的构效关系评估。在基于质谱技术对葡聚寡糖结构分析时发现：在单个糖单元内出现m/z 42/30/30/42/18差值的为糖单元之间通过1,3-键型连接寡糖，而以差值m/z 162出现的则为葡萄糖糖单元之间通过1,6-键型连接的寡糖；单个糖单元内出现m/z 42/42/77的为葡萄糖单元之间通过1,2-键型连接；尤其是发现了在还原端出现差值m/z 162的为末端为果糖单元的寡糖，其可以作为还原端果糖是否除去的标志。发展出了有效提高β1,3-葡聚糖发酵法生产产量的方法，并对从香菇中分离的子实体多糖中的α1,3-葡聚糖和β1,3/1,6-葡聚糖以及β1,3-葡聚糖进行酸解获得了α1,3-葡聚寡糖（DP2-13）和β1,3-葡聚寡糖（DP2-13）以及β1,3/1,6-葡聚寡糖的制备工作（DP2-13），对来源于藻类和布鲁氏菌的α1,2-葡聚寡糖和环形β1，2-葡聚糖进行水解，获得了聚合度不同的系列α1,2-葡聚寡糖（DP 2-9）和β1，2-葡聚寡糖（DP 2-13）。在基于糖芯片技术进行寡糖结构与功能关系分析工作中发现：DC-SIGN和DC-SIGNR均可以识别聚合度大于3的β-1,2-葡聚寡糖。在新型荧光标记探针的合成开发中，已经完成了整个探针的合成工作，但是由于缺少有效的纯化技术，尚无法得到高纯度的探针，我们计划与大连物化所合作，通过HPLC 技术来解决这个问题。本项目研究工作为进一步完善该系统并应用于糖的结构与功效评估奠定了基础。