蛋白激酶Mps1在动粒动态定位的分子机制与效应研究

During mitosis, through equal chromosome segregation, mother cell faithfully transmits the genetic information into two daughter cells. The failure of faithful chromosome segregation during mitosis will generate aneuploidy daughter cells and chromosomal instability (CIN). CIN will drive aggressive tumorigenesis by allowing tumor to evolve rapidly and acquire malignant transformation ability. The spindle assembly checkpoint (SAC) is a surveillance mechanism that ensures accurate chromosome segregation during mitosis. Therefore, elaborating the molecular mechanism of SAC is of great value to promote the health of human being. Mps1 protein kinase plays essential function in SAC in different species. However, the detailed molecular basis of Mps1 kinetochore localization and how does it promote the kinetochore recruitment and activity of Mad2 remain poorly understood. In this proposal, we aim to uncover the molecular basis of kinetochore targeting of Mps1 and explore the function of Mps1 in the maintenance of SAC signaling. Using the methods of molecular biology, cell biology, biochemistry and biophotonics, we will explore the molecular basis of Mps1 kinetochore localization, address the molecular mechanism of how Aurora B and Mps1 itself promote Mps1 recruitment, dissect the complicated interaction between Ndc80 complex and Mps1 and explore and relationship between Mps1 kinetochore and SAC signaling strength. We also aim to explore how Mps1 promote Mad1/Mad2 kinetochore recruitment. Overall, we aim to discover the molecular mechanism of Mps1 kinetochore targeting and how Mps1 ensures Mad1/Mad activity when the SAC signaling in on. We hope our research will provide novel knowledge for the elucidation of chromosomal instability and tumorgenesis.

在有丝分裂过程中，母代遗传信息通过均等的染色体分离精确地传递给子代细胞。染色体分离的失调会导致非整倍体和染色体不稳定性，危害个体发育与健康。纺锤体检验点是保证精准的染色体分离的首要机制，阐明它的调控机制对于促进人类健康具有重要意义。Mps1激酶是维持纺锤体检验点功能的关键因子，但是它在动粒定位的分子机制和它如何调控Mad2的活性仍尚未被阐明。我们拟结合工作基础，利用多学科交叉的手段研究Mps1动粒定位的调控机制，阐明Aurora B和其自身活性调控Mps1动粒定位的分子机制，解析Ndc80复合物与Mps1的相互作用，探究Mps1的动粒定位和纺锤体检验点强度之间的关联。我们也将解析Mps1如何调控Mad2的动粒定位与活性来揭示纺锤体检验点的信息流。通过本项目的实施，我们希望揭示Mps1动粒定位的分子基础和其促进Mad2活性的分子机制，为阐明染色体不稳定性与肿瘤的发生发展提供理论基础。

有丝分裂是真核细胞实现细胞复制的过程，是真核生物进行个体发育和物种延续的基本生命活动。通过均等的染色体分离，有丝分裂产生两个具有均等的母代遗传信息的子细胞。错误的有丝分裂则产生非整倍体子细胞。非整倍体子细胞由于基因表达的不平衡，激活各种应激反应，发生染色体不稳定性，促进癌症发生。纺锤体组装检验点则是保证精准的有丝分裂的一个关键机制。Mps1蛋白激酶是纺锤体组装检验点信号通路的核心分子和上游分子，在动粒上精准的和动态的定位对于检验点信号在前期的迅速起始和中期的及时沉默至关重要。因此，阐明Mps1在动粒定位的分子机制和Mps1如何调控下游效应分子的激活和组装具有重要意义。通过本项目的实施，我们揭示了Mps1与Ndc80复合物之间的多点相互作用介导了Mps1的动粒定位。NTE、TPR、CTE三个元件单独均不能或仅可微弱地定位动粒，而三个元件协同具有高亲和的动粒定位能力。值得一提的是，我们的生化实验表明Hec1的磷酸化显著地增强了所有不同的模拟磷酸化显著地增强了所有不同的Mps1截短突变体与Hec1的结合。为了进一步探索Mps1动粒定位的分子机制，我们比较了全长Mps1-WT、Mps1-KD、Mps1-N300的动粒定位强度，结果表明CT片段含有两个进化中保守的α螺旋，可以增强动粒定位。进一步，我们通过蛋白相互作用分析和人工诱导二聚化、双分子荧光互补、LacO-LacI异位招募体系等细胞学实验表明了CT片段通过二聚化增强Mps1的动粒定位。接下来，我们进一步解析了CT片段的生理功能。 结果表明缺失CT片段的Mps1ΔCT突变体表达的细胞中，Mps1活性减弱，Mad2的动粒定位减弱，纺锤体检验点功能受损。通过活细胞成像实验表明相对Mps1野生型回补表达的细胞，Mps1ΔCT表达的细胞发生后期滞后染色体的比例显著升高。我们还将进一步解析Mad1的结合蛋白网络。总体上，我们的上述研究工作表明了Mps1与Ndc80复合物的多点相互作用、Mps1分子的二聚化以及Mps1的自身磷酸化赋予了Mps1在动粒定位的独特的动力学特征。这些发现丰富了我们对纺锤体检验点信号的认知。