应用piggyBac转座子介导的基因突变进行疟原虫功能基因组学的初步研究

疟疾研究已进入了后基因组时代，阐明众多未知基因的功能是目前研究的主要方向和前沿之一。先前疟原虫基因功能研究多借助于依靠同源整合的基因敲除或敲入，实验周期长，操作难度大，无法满足后基因组时代高通量研究基因功能的需求。最近，piggyBac转座子介导的随机插入基因突变系统应用于恶性疟原虫获得成功，此法可以高效率的产生突变体，必将成为研究功能基因组学的利器。感染鼠的伯氏疟原虫是疟原虫研究重要模式生物，相对于其他种疟原虫有基因转染效率高、操作简单、易于研究生活史各阶段的优势，因此对其功能基因组学的研究是疟原虫功能基因组学研究的重要方向。本研究将在伯氏疟原虫中建立高效piggyBac转座子介导的基因突变系统，应用于功能基因组学研究，通过随机插入突变和基因捕获等方法，获得大量插入功能基因的突变体，鉴定其基因型和表型变化，以发现新的疟原虫功能基因。这将为开发新的疫苗、药物，寻找新的控制方法提供基础。

疟疾研究已进入了后基因组时代，阐明众多未知基因的功能是目前研究的主要方向和前沿之一。piggyBac转座子介导的随机插入基因突变系统应用于疟原虫，高效产生突变体，将是开展疟原虫功能基因组学的研究利器。感染鼠的伯氏疟原虫是疟原虫研究重要模式生物，相对于其他种疟原虫有基因转染效率高、操作简单、易于研究生活史各阶段的优势，因此对其功能基因组学的研究是疟原虫功能基因组学研究的重要方向。本项目的研究目的就是在伯氏疟原虫中建立高效piggyBac转座子介导的基因突变系统，并应用于功能基因组学研究，发现新的疟原虫功能基因。. 本研究中，我们构建了piggyBac介导P.berghei基因转染的辅助质粒体——供体质粒体系，包括1个用于瞬时表达piggyBac转座酶的辅助质粒和分别用于抗性筛选、启动子捕获、基因捕获的8个不同功能的供体质粒。建立了基因转染的技术流程，优化了各项转染条件。在此基础上，通过多次转染实验，获得了大量P.berghei基因组的插入突变体，利用inverse PCR、高通量测序、TAIL PCR等方法共鉴定了73个突变体的基因型（既基因组的不同插入位点），尤其是建立了利用新一代高通量测序技术和相应的生物信息学分析高通量、高效率的鉴定插入突变体基因型的方法，并利用此法鉴定了其中的47个基因组插入位点。为今后利用piggyBac转座系统介导的插入突变开展大规模疟原虫功能基因研究奠定了技术基础。本研究中，我们还通过启动子捕获和基因捕获的转染体系，证实了此两种方法可以用于P.berghei研究，并利用报告基因在疟原虫中的表达特征发现2个新的功能基因PBANKA_071260（14-3-3，putative）和PBANKA_123160（ ApiAP2，putative），有限稀释法获得了相应基因插入突变的单克隆转化子，为进一步基因功能研究打下基础。.