piggyBac转座子介导的弓形虫速殖子-缓殖子转换分子机制研究

弓形虫作为一种重要的人兽共患寄生虫，侵入机体后，从速殖子转变为缓殖子，逃避宿主免疫系统和药物的攻击；当机体免疫功能受损时，缓殖子转变为速殖子，引起急性感染。弓形虫速殖子-缓殖子转换分子机制研究对于弓形虫病防控具有重要意义。piggyBac转座子是来源于鳞翅目昆虫的DNA转座子，作为一种基因诱变工具，具有转座效率高、负载容量大、宿主特异性差等特点。本研究拟构建弓形虫速殖子、缓殖子特异性表达蛋白SAG1、BAG1调控元件控制的报告基因GFP、RFP表达盒，串联后构建弓形虫piggyBac转座系统，鉴定其弓形虫体内的转座特性；建立弓形虫突变体克隆，体外诱导缓殖子，运用荧光显微镜筛选缓殖子形成缺陷或减弱突变体，通过反向PCR技术确定piggyBac转座子的插入位点，确定弓形虫速殖子-缓殖子转换相关分子，阐述弓形虫速殖子-缓殖子转换的分子机制，为弓形虫药物治疗及疫苗研制提供新的靶标奠定基础。

本研究运用PCR及分子克隆技术获得了弓形虫速殖子、缓殖子特异性表达蛋白SAG1、BAG1的启动子序列和多聚腺苷酸信号序列，构建速殖子特异性报告基因表达盒pSAG-RFP-GRA，piggyBac转座子表达载体PB/SAG-RFP-GRA、pPB-DHFR-RFP和pPB-CAT，以及表达转座酶的辅助质粒pSAG-Pbase-GRA。将转座子表达载体pPB/SAG-RFP-GRA和辅助质粒Toxo-PBase通过电穿孔共转染弓形虫滋养体，通过流式细胞仪检测，表明辅助质粒Toxo-PBase能明显增强转座子表达载体PB-Toxo-RED的转染效率（70%），而表达载体PB-Toxo-RED转染效率仅40%。证实piggyBac转座子能明显提高弓形虫转染效率，在弓形虫体内具有转座活性。. 将转座子表达载体pPB-DHFR-RFP和pPB-CAT分别与辅助质粒Toxo-PBase共转染弓形虫，通过抗性筛选及有限稀释获得单克隆虫体，经反向PCR及序列分析，表明piggyBac转座子插入弓形虫基因组并非TTAA特征序列，可能是依赖于药物的选择压力而随机整合入基因组。. 丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是细胞内的一类丝氨酸／苏氨酸蛋白激酶，在细胞增殖、分化等过程中起重要作用。本研究通过荧光定量RT-PCR技术证实弓形虫GT1株在不同缓殖子诱导条件下（碱性、温度）MAPK1的表达量明显增高，碱性诱导条件下MAPK1表达量约是温度诱导条件的10倍，提示MAPK1是一种与应激相关蛋白，参与速殖子-缓殖子转化基因表达的调节。以CAT为筛选标记构建弓形虫MAPK1打靶载体，转染弓形虫后，经CAT筛选、有限稀释获得单克隆虫体，经PCR、RT-PCR及Southern blotting鉴定，获得弓形虫MAPK1缺失株。通过荧光定量RT-PCR检测，表明弓形虫MAPK1缺失株在不同缓殖子诱导条件下，缓殖子特异性表达蛋白BAG1的表达量与GT1株有显著差异，明显低于GT1株，进一步证实弓形虫MAPK1参与速殖子向缓殖子的转化，可能成为弓形虫药物治疗及疫苗研制的新靶点。. 通过上述研究，获教育部自然科学一等奖1项，吉林省自然科学学术成果一等奖1项，专利授权1项，发表SCI论文11篇，培养研究生2名。