精子介导piggyBac转座子高效制备转基因动物机理研究

精子载体法进行基因转移具有操作简便等优点，但精子载体法在哺乳动物上应用存在着极大的随机性和不确定性，总结精子介导质粒转基因的资料，我们认为精子能吸附、内化外源DNA并将其携带进入卵母细胞，外源DNA整合入基因组的低效率导致精子载体法体系不稳定。而PiggyBac转座子能主动将外源基因整合入基因组，因此我们提出假设，精子介导piggyBac转座子进行基因转移能提高精子载体法的效率和稳定性。为了验证该假设提出如下研究内容通过检测精子吸附和内化外源的转座子DNA、质粒DNA和线性化DNA的效率，转座子与其他载体进入卵母细胞后介导外源基因整合入基因组效率，转座子整合位点对胚胎发育影响及精子载体法出生的转基因动物中外源基因的表达和遗传稳定情况，对精子介导转座子方法制备转基因动物的效率和体系进行研究，阐明精子介导转座子进行基因转移的机理，以期建立成熟稳定的精子介导制备转基因动物的技术平台。

精子介导的基因转移技术简单易行，其作为制备转基因动物的一种方法已经被很多科学家所认同，但是不同实验室的研究结果显示其稳定性和重复性较低，转基因效率差异极大。首先本研究系统评价了精子介导基因转移的各关键环节中的相关因素对基因转移的影响。 其次本研究通过阐明piggyBac转座子转基因载体将外源基因（EGFP）导入到猪的胎儿成纤维细胞过程作用机制，并通过将携带转座子的转基因细胞作为核移植供体细胞制备转基因猪核移植胚胎，通过外源基因在胚胎中的表达和胚胎的发育情况，系统的评价了piggyBac转座子作为转基因载体在猪的转基因中作用机制。结果发现:300 nmol/L外源DNA与精子共孵育后，洗涤前精子结合外源DNA的效率为100%，消化后精子阳性率为76% ；诱导顶体反应后，精子顶体部DNA会有丢失，但结合外源DNA的精子比率没有降低。300 nmol/L DNA共孵育的精子获得合子期胚胎的阳性率为27.89%，显著高于15 nmol/L组。单囊胚PCR检测300 nmol/L 的pEGFP-C1质粒与精子共孵育转基因胚胎阳性率为21.50%；采用RT-PCR方法在300 nmol/L组的囊胚中检测到了GFP基因 RNA的表达。这些结果显示精子具备结合和内化外源DNA的能力，并能将外源DNA带入卵母细胞，顶体反应会使精子丢失部分DNA，受精过程外源DNA在基因组中的整合及外源基因表达激活是精子介导法基因表达的关键影响因素。对piggyBac转座子体系的研究结果表明，piggyBac转座子体系得到的细胞集落数是pEGFP-C1体系得到的细胞集落数的18倍，说明转座子体系获得的稳定转染细胞效率显著高于随机整合体系。利用基因组步移技术检测了piggyBac转座子插入位点序列，结果表明转座子片段均是以转座的方式整合到基因组上，位点为TTAA四核苷酸位点。同时将插入位点定位于猪的2,9,15号染色体，这说明转座子是多位点转座整合外源基因的。piggyBac转座子能高效的介导外源基因在猪体细胞中的表达，表达量是随机整合法的4倍。无论是piggyBac转座还是pEGFP-C1的随机整合，核移植胚胎的卵裂率，囊胚率和囊胚细胞数都没有显著差异，表明piggyBac转座不影响核移植胚胎的发育。