CaMKII及ILK在周期性机械应力优化组织工程软骨过程中的作用及机制研究

Periodic mechanical stress could significantly promote chondrocyte proliferation and migration through Src-PLCγ1-ERK1/2 signaling cascade. However, other singal proteins excluded Src, PLCγ1 and ERK1/2 involved in these processes have not been well delineated. By mass spectrometry, we screened that the phosphorylation levels of CaMKII and ILK were significantly enhanced exposed to periodic mechanical stress. Thus, we hypothesised that CaMKII and ILK were responsible for chondrocytic biological effects induced by periodic mechanical stress. In order to verify the above hypothesis, we use Western bloting to determine the activity of CaMKII and ILK under periodic mechanical stresss to test the results of mass spectrometry. Then, we adopt shRNA technique to inhibit the activation of CaMKII and ILK, and we use direct cell counting, Western bloting and wound healing assay to detect the roles of CaMKII and ILK in periodic mechanical stress-upregulated chondrocyte proliferation and migration, including the upstream and downstream relationships among these signaling proteins. At last, we adopt histological and immunohistochemical to assess the quality of cartilage tissue formation in vitro and in vivo after CaMKII up-regulation or ILK up-regulation under periodic mechanical stress, with a view to seeking convincing methods for constructing better quality tissue-engineered cartilage in future.

周期性应力能通过Src→PLCγ1→ERK1/2信号通路促进软骨细胞增殖、迁移，但是还有哪些信号蛋白参与这一系列过程尚不清楚。通过质谱技术，我们筛选出周期性应力下软骨细胞中CaMKII及ILK磷酸化水平明显增高。因此，我们猜想CaMKII及ILK均能调控周期性应力下软骨细胞活性。为了验证该假说，我们拟先用蛋白质印记等方法验证质谱结果，明确周期性应力下，CaMKII及ILK是否激活，继而阻断CaMKII或ILK，运用细胞计数、蛋白质印记、细胞划痕实验等方法确定CaMKII或ILK对周期性应力下：二维培养的软骨细胞增殖、迁移的作用，以及相应信号蛋白之间的上下游关系。最后分别将CaMKII或ILK上调，用组织学、免疫组化等检测方法从体外、体内两方面确定周期性应力下：CaMKII或ILK上调能否构建更加优质的组织工程软骨，为进一步提高组织工程软骨的质量提供理论依据。

周期性应力能通过Src→PLCγ1→ERK1/2信号通路促进软骨细胞增殖、迁移，但是还有哪 些信号蛋白参与这一系列过程尚不清楚。通过质谱技术，我们筛选出周期性应力下软骨细胞中 CaMKII、ILK、Pyk2磷酸化水平明显增高。因此，我们猜想CaMKII、ILK及Pyk2均能调控周期性应力下软骨细胞活性。为了验证该假说，我们拟先用蛋白质印记等方法验证质谱结果，明确周期性应力下， CaMKII、ILK及Pyk2是否激活，继而阻断CaMKII、ILK或Pyk2，运用细胞计数、蛋白质印记、细胞划痕实验等 方法确定CaMKII、ILK或Pyk2对周期性应力下:二维培养的软骨细胞增殖、迁移的作用，以及相应信号蛋白之间的上下游关系。我们发现周期性机械应力能通过激活Integrinβ1–CaMKII–Pyk2–ERK1/2、Integrinβ1-ILK- ERK1/2通路两条信号通路来促 进软骨细胞增殖及细胞外基质合成。我们还发现除Integrinβ1之外的另一个重要感受器IGF1R同样在软骨细胞的机械信号传导通路中发挥重要作用。我们发现周期性机械应力 也能通过激活IGF1R- ERK1/2通路来促进软骨细胞增殖及细胞外基质合成。由于一型胶原与软骨细胞纤维化有关，减少一型胶原的合成对维持软骨细胞表型，降低去分化进程起着至关重要的作用。我们研究了与一型胶原密切相关的两个蛋白GSK3-beta及beta-catenin在软骨细胞的机械信号传导通路中发挥的作用。我们发现周期性机械应力能通过激活GSK3-beta及beta-catenin从而降低beta-catenin总量的表达，最终减少一型胶原的合成。我们的研究结果将为进一步深入探讨如何提高组织工程软骨的质量奠定基础。