基于靶向多肽链活性位点特异性适配体的新型荧光定量PCR应用于生物活性蓖麻毒素鉴定的研究

鉴定蓖麻毒素是否具备生物活性是目前蓖麻毒素检测中存在的难题。本课题拟利用蓖麻毒素A、B链活性部位的特点，通过亲和消减SELEX技术，以活性部位被封闭前后的蛋白作为筛选靶标和反向筛选靶标，最终获得分别特异性靶向A、B链活性位点的核酸适配体；并筛选最佳配对适配体分别作为捕获分子和检测报告分子，以夹心检测靶蛋白的形式，构建新型实时荧光定量PCR体系，应用于生物活性蓖麻毒素的高选择性、高灵敏度的体外快速直接检测。本课题的研究将为蓖麻毒素的检测提供有效的定性、定量及生物活性鉴定方法，对于检验医学、维护公共卫生安全和防范生物恐怖袭击等方面将具有十分重要的意义。

鉴定蓖麻毒素是否具备生物活性是目前蓖麻毒素检测中存在的难题。本课题拟利用蓖麻毒素 A、B链活性部位的特点，通过亲和消减SELEX 技术，筛选特异结合靶蛋白的核酸适配体，从而构建基于适配体的新型实时荧光定量PCR 体系，应用于生物活性蓖麻毒素的高选择性、高灵敏度的体外快速直接检测。在本项目中，首先针对目前提取纯化蓖麻毒素蛋白方法所存在的不足，建立了一种简便高效适合实验室从蓖麻籽中规模化制备活性蓖麻毒素的方法。应用MALDI-TOF以及LC-MS质谱技术，能够对蓖麻毒素进行定性及定量鉴定，而且利用活性毒素的体外脱嘌呤反应原理，应用质谱技术能够对最适宜作为A链糖苷酶活性作用底物的核酸序列进行筛选，并依此建立了相应的核糖体失活蛋白毒素的体外毒性分析方法。利用课题组前期已经筛选获得的高亲和力高特异性针对人重组促红细胞生成素rHuEPO的核酸适配体807-39nt，本项目建立了基于核酸适配体的实时荧光定量检测技术。分别构建“杂交后识别”策略A和“杂交前识别”策略B，通过实时定量PCR技术，实现对缓冲液、人工尿液及复杂血液基质体系中rHuEPO-α的测定。建立的该检测技术具有普适性，已证实可应用于对凝血酶以及ATP分子的灵敏特异性检测。另外，结合蓖麻毒素体外脱嘌呤活性以及分子信标的方法，设计了茎环结构的核酸反应底物，利用荧光共振能量转移现象，建立了基于荧光定量PCR的方法，实现对蓖麻毒素活性的鉴定和检测，可初步实现检测浓度低至10ppb的活性毒素。通过本课题的研究，将为蓖麻毒素的检测提供有效的定性、定量及生物活性鉴定方法，对于检验医学、维护公共卫生安全和防范生物恐怖袭击等方面将具有十分重要的意义。