新型葡萄球菌肠毒素SElX样蛋白催吐活性及其活性位点研究

Staphylococcal enterotoxin-induced food poisoning is a global food safety issue. Emetic activity is an important biological property of enterotoxins and is closely related to food poisoning. However, the mechanism and site of emetic activity of enterotoxins are not yet clear.In our previous study, we found for the first time that the ST398 strains, an important epidemic clone of China, can cause an outbreak of food poisoning, and all outbreak strains carried a novel enterotoxin which was highly homologous to the C-terminus of enterotoxin-like SElX and was named as the SElX-like protein.We combined the patients' vomiting symptoms, the previously reported emetic epitopes of enterotoxin SEA and its 3D structure, and amino acid comparisons of various enterotoxin toxins to scientifically speculate and propose that the SElX-like protein has an emetic activity and a spatial conformation of emetic epitopes. This project aims to evaluate the biological properties of the SElX-like protein by its emetic activity, superantigenicity and stability. The anti-serum of synthetic peptides and single/multiple site mutations strategies were further used to investigate the emetic activity site.This is the first time to explore the emetine activity site of the novel enterotoxin SElX-like protein, which can provide new ideas and targets for the development of anti-emetic drugs and vaccines, and provide a theoretical basis for the prevention and control of food poisoning in food safety.

金葡菌肠毒素食物中毒是重要的全球性食品安全问题。催吐活性是其肠毒素的一个重要生物学特性，并与食物中毒症状密切相关，但催吐机制及催吐活性位点还不明确。本课题组前期研究首次发现我国重要金葡菌流行克隆ST398型菌株可以引起食物中毒暴发,并携带了一个新型肠毒素（与类肠毒素SElX的C端高度同源，命名为SElX样蛋白）。本课题结合病人临床呕吐症状及文献报道的部分同源肠毒素催吐活性表位比对，首次提出了SElX样蛋白具有催吐活性，并存在空间构象位置接近的催吐活性区域的假说。本课题拟通过SElX样蛋白的催吐活性、超抗原性及稳定性分析，系统评价其生物学特性；采用人工合成分解肽段抗血清和单/多点突变评价策略确定其催吐活性位点。本研究通过对新型肠毒素SElX样蛋白的催吐活性及位点分析与确认，可为抗呕吐药物和疫苗的研制提供新的思路及靶点，并为食品安全中的金葡菌食物中毒的预防控制提供理论基础。

葡萄球菌肠毒素是金黄色葡萄球菌产生的重要毒力因子，既可以作为超抗原诱导T淋巴细胞的异常快速增殖并释放大量的炎性细胞因子，同时也具有催吐活性引起食物中毒。本课题组前期发现我国重要金葡菌流行克隆ST398型菌株可以引起食物中毒暴发,并携带了2个类肠毒素，分别为SElX样蛋白（tSElX）和SElW蛋白，但是这2个蛋白的生物学功能还未知。本研究针对两个类肠毒素开展研究，通过狨猴动物试验，证明了新型肠毒素SElX样蛋白（tSElX）和类肠毒素SElW蛋白均不具有催吐活性。发现tSElX与完整SElX和其它经典肠毒素SEA相比，具有较弱的超抗原活性。但是SElW具有较强的超抗原活性，在较低浓度即可以刺激人外周血单核细胞产生IL-2和INF-γ。编码SElW蛋白的基因在我国金黄色葡萄球菌菌株中分布广泛，对986株我国不同来源的金葡菌进行检测，100%的菌株均携带该基因。对54个ST型（19个CC克隆群）的82株菌，进行序列分析，发现SElW的氨基酸序列共有47（21.2%）个突变位点，N-端的保守性较C-端低。稳定性评价发现SElW具有一定的热稳定性，不具有胃蛋白酶和胰酶耐受性。利用对接模型预测了SElW蛋白与TCR结合的5个重要的超抗原活性位点，分别是Y18、N19、W55、C88和C98。对突变体SElW-C88A和SElW-C98A进行超抗原活性评价，发现88和98位点并不是影响SElW与TCR结合的最重要的位点。通过对SElW体外抗肿瘤活性检测，发现SElW具有较好的抗肿瘤作用，蛋白浓度0.0001-1µg/ml在体外刺激PBMCs后对乳腺癌肿瘤细胞MCF-7的杀伤作用较强，肿瘤细胞生长抑制率达到70%。通过本课题研究，详细阐释了SElW蛋白的生物学活性，进一步探索了该蛋白在与宿主细胞结合的致病机制及该蛋白在抗肿瘤药物研发方面的应用前景。