百合花青素苷转运LhDTX35基因上游调控的分子机制

The research on regulatory mechanism of floral color is hot topic to new variety breeding in ornamental plant. It is unclear that the mechanism of anthocyanin transportation, though anthocyanins is the most important pigments for floral coloration and it should be transported and accumulated to vacuole to coloration. We previously found that LhDTX35 gene encoded MATE protein was involved in anthocyanin transportation, however the upstream regulatory mechanism is not clarified. “Tiny Padhye” is beneficial to characterize the molecular mechanism of anthocyanin metabolism under the same genetic background due to the petal coloration pattern that it is purple on bases of petal and colourless on upper parts of petal. Hence “Tiny Padhye” is excellent material to study the regulatory mechanism of anthocyanin transportation. Therefore, in the study, in order to reveal the upstream regulatory mechanism of LhDTX35 gene involved in anthocyanin transportation in Lilium, the promotor activity of LhDTX35 gene at different region and promotor type in response to environmental factor are studied in Lilium, meanwhile the interaction mechanism between the candidate transcription factors and promoter was characterized using “Tiny Padhye” as material. The research proposal could provide theoretical basis for clarifying the mechanism of anthocyanin transportation in Lilium, and could provide the new gene resource in molecular breeding for flower colors modification. It possessed high scientific value and application prospect on genetic engineering of floral color in Lilium.

花色调控机理研究是观赏植物新品种培育的热点问题。花青素苷是花朵呈色的重要色素，只有转运并积累到液泡中才显现颜色，但其转运机制尚不明确。前期研究发现编码MATE蛋白的LhDTX35基因参与了百合花青素苷的转运，但其上游调控机理未见系统报道。亚洲百合品种“Tiny Padhye”的花瓣上部无色下部有色，其着色类型便于在同一遗传背景下研究花青素苷代谢的分子机制，在解析花青素苷转运调控机理中有其独特的优势。因此，本申请项目拟以“Tiny Padhye”为材料，研究百合LhDTX35基因启动子不同区域的活性和启动子对外界环境因子的响应类型，探讨候选转录因子与LhDTX35基因启动子互作机理，揭示LhDTX35基因参与百合花青素苷转运的上游调控分子机制。本项目可为深入理解百合花青素苷转运机制奠定理论基础，亦可为百合花色分子改良育种提供新的基因资源，对百合花色基因工程具有重要的科学价值和应用前景。

花色调控机理研究是观赏植物新品种培育的热点问题。花青素苷是花朵呈色的重要色素，只有转运并积累到液泡中才显现颜色，但其转运机制尚不明确。前期研究发现编码MATE蛋白的LhDTX35基因参与了百合花青素苷的转运，但其上游调控机理未见系统报道。亚洲百合品种“Tiny Padhye”的花瓣上部无色下部有色，其着色类型便于在同一遗传背景下研究花青素苷代谢的分子机制，在解析花青素苷转运调控机理中有其独特的优势。本项目通过染色体步移法用锚定引物AP3成功获得‘Tiny Padhye’LhDTX35基因的启动子序列。生物信息学分析发现该序列含有启动子基本元件，激素响应元件，光响应元件和逆境响应元件。启动子全长和截断的亚细胞定位实验发现启动子全长序列能驱动GFP蛋白在保卫细胞内特异表达，和拟南芥DTX35基因启动子的亚细胞定位结果一致，说明该序列具有启动子的核心区域。不同发育时期的花瓣有色区域和无色区域的激素含量分析，发现赤霉素在不同发育时期有色部分的含量变化和花青素苷含量变化趋势相一致，此外，细胞分裂素在S4时期即开花当天有色部分的含量达到峰值，显著高于无色部分的含量，该研究结果暗示，赤霉素和细胞分裂素与LhDTX35基因参与的花青素苷的转运呈正相关。通过酵母单杂实验成功获得与LhDTX35基因启动子互作的200个上游调控因子的阳性克隆。通过BLASTx软件分析了200个阳性克隆的序列，获得78个上游调控因子基因片段特征。实时荧光定量qRT-PCR实验筛选出19个上游调控因子在S2时期花瓣的有色部分的表达量显著低于无色部分的表达量，2个上游调控因子在S2时期花瓣的有色部分的表达量显著高于无色部分的表达量。酵母单杂一对一验证实验进一步验证已筛选出的21个调控因子，最终获得14个负调控因子和2个正调控因子阳性酵母克隆。综上所述，本研究最后获得LhDTX35基因的14个上游负调控因子，2个上游正调控因子。该项目可为深入理解百合花青素苷转运机制奠定理论基础，亦可为百合花色分子改良育种提供新的基因资源，对百合花色基因工程具有重要的科学价值和应用前景。