miR-133a调控SRPK1上调VEGF165b对早产儿视网膜病变的作用及机制

Retinopathy of prematurity (ROP) is the leading cause of children blindness in the world, which manifests the retinal neovascularization and visual dysfunction. At present, there lacks effective methods to treat ROP. Our preliminary study found that miR-133a was significantly down-regulated in the retinae of the ROP animal models and overexpression of miR-133a obviously inhibited the migration of the endothelial cells and protected the retinal neuron cells against hypoxia. Bioinformatics prediction and preliminary experiment demonstrated that Serine-arginine protein kinase (SRPK1) was the target gene of miR-133a and SRPK1 was an important factor to mediate the splice site choice for VEGF. Accordingly, this study intends to observe regulation of miR-133a on SRPK1 and VEGF165b both in vivo and in vitro, to observe the effect of miR-133a on the cell abilities and functions of retinal vascular endothelial cells and neuron cells after hypoxia stimulation and to verify the long-term efficacy and mechanism in the animal models with AAV2-mediated miR-133a virus. This study will clarify the anti-angiogenic and neuron-protective mechanisms of miR-133a by up-regulating VEGF165b through targeting SRPK1, which may provide a new intervention strategy for ROP treatment.

早产儿视网膜病变（ROP）是世界儿童致盲的主要原因，其表现为视网膜新生血管及视觉功能障碍，目前尚缺乏有效的治疗方法。我们前期研究发现ROP动物模型中视网膜内miR-133a显著下调，过表达miR-133a能抑制血管内皮细胞的侵袭和保护低氧刺激下的神经元。生物信息学预测及初步验证丝氨酸-精氨酸蛋白特异性激酶1（SRPK1）是miR-133a的靶基因，而SRPK1是调控VEGF选择性剪接的重要分子。因此，本项目拟通过体内外模型观察miR-133a对SRPK1与VEGF165b的调控规律，探讨miR-133a对低氧条件下视网膜血管内皮及神经元细胞各种能力及功能的影响，并构建AAV2介导的miR-133a病毒，在动物模型上验证其长期疗效及机制。本研究通过阐明miR-133a调控SRPK1上调VEGF165b拮抗新生血管及保护神经元细胞的分子机制，为ROP治疗提供新的干预手段。

早产儿视网膜病变（ROP）是世界上儿童致盲的主要原因之一，其表现为视网膜新生血管及视觉功能障碍，目前尚缺乏有效的治疗方法。本研究拟阐明miR-133a调控SRPK1上调VEGF165b拮抗新生血管及保护神经元细胞的分子机制。本研究构建了小鼠氧诱导视网膜病变（OIR）模型以及低氧细胞模型，Q-PCR、Western Blot以及ELISA方法检测miR-133a及其相关基因及蛋白的表达。双荧光素酶实验验证miR-133a对SRPK1的调控作用。MTT法检测细胞活性。划痕、侵袭以及成管实验观察视网膜血管内皮细胞的功能。TUNEL法检测神经元细胞的凋亡。玻璃体腔内注射AAV2介导的miR-133a，视网膜铺片观察视网膜新生血管，视网膜电图检测视网膜神经元功能。Western Blot检测血视网膜屏障及凋亡相关蛋白的表达。Q-PCR检测玻璃体腔内注射AAV2-miR133a后miR-133a、SRPK1及VEGF在眼内的长期表达情况。研究发现体内及体外ROP模型中miR-133a的表达下调，而SRPK1和total VEGF（或VEGF165a）的表达显著上调。经miR-133a angomiR干预后，SRPK1和total VEGF（或VEGF165a）的表达显著下调，而VEGF165b的表达不变或显著上调。双荧光素酶实验证实SRPK1为miR-133a的下游靶基因。体外条件下miR-133a可以抑制视网膜血管内皮细胞的增殖、迁移、侵袭以及成管功能，miR-133a能够抑制CoCl2引起的大鼠神经元细胞的凋亡，其机制可能是通过抑制促凋亡基因Bax以及上调抑制凋亡基因Bcl-2。眼内注射AAV2-miR-133a可以显著抑制OIR小鼠视网膜新生血管以及部分提高小鼠视网膜神经元功能。MiR-133a可以挽救OIR小鼠视网膜内VE-cadherin的表达。玻璃体腔内注射AAV2-miR-133a可以实现miR-133a在小鼠眼内的长期表达，同时其能持续有效地抑制小鼠视网膜内SRPK1以及VEGF的表达。本研究发现miR-133a通过调控SRPK1上调VEGF165b实现了抑制视网膜新生血管、维持视网膜神经元功能的作用，且AAV2介导的miR-133a可以实现眼内的长期表达及抑制作用，为ROP的治疗提供了新的理论依据及干预方法。