探寻ClpE影响肺炎链球菌毒力的分子机制

ClpE 是一种仅存在于革兰氏阳性菌中的HSP-100/ClpATP酶，它不仅具有分子伴侣的功能，还可与ClpP形成蛋白酶复合物，负责特异性识别水解蛋白底物，在多种病原菌的致病过程中发挥着重要作用。我们前期的实验发现了ClpE可以影响肺炎链球菌的毒力，调控了多种毒力因子的表达水平，但其具体的作用机制还不清楚。本研究拟利用基于SOS恢复系统的酵母双杂交，以ClpE为诱饵，从肺炎链球菌的cDNA文库中，寻找与ClpE作用的特异性底物，从而分析其对相关蛋白的作用途径，初步阐明ClpE调控肺炎链球菌毒力因子表达的分子机制。本项目不仅可为理解肺炎链球菌致病的分子机理奠定基础，还可为肺炎链球菌的防治提供新的候选靶点。

本研究按计划完成了该项目的研究，并达到了预期成果。其完成情况如下：.1.成功构建了ClpE原核表达载体pET28a-ClpE，获得了纯度大于85%的重组蛋白ClpE。纯化的rClpE抗原分别免疫BALB/c小鼠和新西兰大白兔，获得了兔和鼠两种来源的rClpE多克隆抗体。.2.Western blot证实诱饵质粒pBT-ClpE可以正常表达，而且自激活实验证实其无自主激活报告基因作用。通过大肠杆菌双杂交系统的筛选，我们最终得到了25个阳性克隆。经过PCR和测序鉴定，有2个DNA片段在pTRG载体上有正确表达，分别是细胞分裂蛋白FtsW和推测的组氨酸激酶SPD_2019。我们重新构建了含有全长片段的pTRG-FtsW/SPD_2019载体，并通过双杂交系统验证他们与ClpE具有相互作用。.3、通过免疫共沉淀实验的筛选，最终我们得到了6个ClpE相互作用蛋白，分别是丙酮酸氧化酶SpxB,氨肽酶PepN，l-乳酸脱氢酶Ldh,核糖体蛋白RpsD, 磷酸烯醇丙酮酸蛋白磷酸转移酶PtsI, 氨甲酰基-磷酸合成酶CarB。我们选择其中与细菌毒力密切相关的SpxB和PepN进行了双杂交系统的验证，证明这两个蛋白与ClpE具有相互作用。.4、对FtsW蛋白的初步功能研究结果显示，FtsW在细菌处于热应激时表达增高。β-半乳糖苷酶活性测定显示FtsW的降解在D39∆clpE菌中要慢于野生菌.主要研究结果：.1、通过本研究共筛选到8个蛋白可能与ClpE具有相互作用，其中蛋白FtsW、SPD_2019、PepN和SpxB通过鉴定确与ClpE具有相互作用，提示ClpE可能通过调节这些蛋白的含量来影响细菌相关性质及毒力，这为后续进一步探索ClpE参与肺炎链球菌致病的分子机制奠定了基础。.2、细胞分裂蛋白FtsW蛋白表达受热应激诱导，而ClpE参与FtsW的降解，提示ClpE对细胞分裂的影响可能是通过调控FtsW的蛋白水平来实现的。