小反刍兽疫病毒反向遗传操作平台建立及标记疫苗构建

本项目拟将采用负链RNA病毒反向遗传操作构建小反刍兽疫（PPR）表位缺失的标记弱毒疫苗，使得能够通过血清学方法区别疫苗接种和野毒自然感染免疫反应。首先，将建立PPR弱毒疫苗株Nigeria/75/1的反向遗传操作系统，同时鉴定、筛选出PPR病毒 N蛋白内存在的B细胞优势免疫表位，并研制出相应的单抗，建立基于该单抗的竞争ELISA检测方法。在此基础上，通过反向遗传操作对N蛋白优势免疫表位进行人工突变修饰，救获突变的疫苗株并评估其体外细胞培养等生物学特性。分别利用上述表位突变疫苗株和野生型Nigeria/75/1疫苗株接种山羊或绵羊，通过上述单抗竞争ELISA检测方法及中和抗体测定方法对两种病毒免疫血清进行比较研究，验证该标记疫苗区别疫苗接种和野毒自然感染免疫反应的可行性，同时评估其免疫保护效力。

小反刍兽疫（PPR）是由小反刍兽疫病毒（PPRV）引起的一种高度接触性传染性疾病，严重危害山羊、绵羊等动物。其于2007年传入我国西部边境地区，对我国畜牧养殖业形成严重威胁。目前主要使用PPRV弱毒疫苗株（Nigeria75/1），但其存在不能够区分疫苗免疫与野毒自然感染的严重缺陷，妨碍PPRV的血清学监测。负链RNA病毒的N蛋白在遗传上比较保守，具有良好的免疫原性，是融合外源表位或缺失优势表位的合适目标蛋白。负链RNA病毒的反向遗传操作技术提供了标记疫苗开发的新途径，但PPRV的反向遗传操作技术在世界范围内是个空白。本项目研究目的是建立PPRV反向遗传技术平台，并以此为基础开发缺失标记疫苗和表达口蹄疫或蓝舌病优势免疫抗原的重组双价疫苗。.首先，构建了PPRV全基因组的感染性克隆、插入了GFP基因的感染性克隆、表达PPRV N、P和L蛋白的辅助质粒，体外共转染感染性克隆和辅助质粒，成功救获表达GFP的重组PPRV（rPPRV/GFP），由此建立了PPRV的反向遗传操作平台。利用rPPRV/GFP表达的GFP易于观察的优势，以其替换传统PPRV弱毒，建立了快速PPRV中和试验，极大地缩短了试验时间。.标记疫苗构建采用了两种策略，首先，改造GFP为分泌锚定型膜蛋白（GFP-SA），并拯救出表达GFP-SA的重组PPRV，其表达的GFP-SA能够嵌合在细胞膜表面；但在免疫试验中，由于操作失误，没有诱导出显著GFP抗体，因此其作为标记疫苗的免疫效果需要重复免疫试验。其次，构建了融合HA表位的N蛋白，并拯救出表达此融合蛋白的重组PPRV，生长动力学试验结果表明HA的融合对病毒复制有所影响，但病毒滴度仍然能满足该重组病毒今后作为标记疫苗的使用，动物免疫试验在进行之中。.为了寻找可用于缺失的N蛋白优势表位，根据已报道文献，合成了多种亚型PPRV的N蛋白优势表位多肽，但其与PPRV免疫羊的高免血清不反应，不适合作为缺失标记疫苗中进行缺失的优势表位。优势表位的筛选试验在进行之中。.最后，本项目成功建立了小反刍兽疫反向遗传操作平台，把其应用于构建了两株标记疫苗，此外，建立了快速PPR病毒中和试验。本项目的成果为今后小反刍兽疫的基础和应用研究打开了新的局面奠定了研究基础。本项目发表SCI论文和核心期刊论文各一篇，获得国家发明专利授权一项，培养博士生1名，硕士生2名。