Importin13对视网膜发育及视网膜前体细胞增殖分化调控研究

Importin13（IPO13）是新近发现的双向核质转运蛋白，可介导Pax6、Pax3、Crx等与眼部发育密切相关的转录因子入核并帮助真核起始因子eIF1A出核。我们的前期研究发现IPO13是角膜上皮干细胞的全新标志物，对维持上皮干细胞高增殖低分化特性起重要作用，但其在视网膜发育及视网膜细胞命运决定中的作用还不清楚。本研究通过检测正常视网膜发育不同阶段中IPO13转录及表达的量和部位的动态变化，利用活体电穿孔基因转移技术对胚鼠及新生鼠视网膜前体细胞进行IPO13持续表达或基因沉默干预，并通过慢病毒转染技术在体外培养的视网膜前体细胞内持续表达IPO13或进行RNA干扰，从发育和体内、外基因表达干预的多个层面探讨IPO13对视网膜细胞增殖、分化的时空特异性调控作用，为阐明视网膜干细胞的增殖分化调控机制以及视网膜变性疾病的细胞替代治疗提供必要借鉴和崭新思路。

视网膜是人体感知外部世界、向中枢神经系统传递视信号的复杂神经网络结构。视网膜退行性疾病是一类多种因素致病的神经退行性疾病，发病机制复杂，致盲后尚无良好治疗手段，细胞替代疗法有望为治疗这类疾病带来新的契机。细胞移植替代治疗中的关键问题是细胞来源及分化状态问题。目前人视网膜神经细胞的发育机制尚不清楚，视网膜干细胞及前体细胞的体外培养和定向诱导分化仍存在很大困难。本项目原研究计划重点关注IPO13在视网膜前体细胞和视网膜发育中的作用，在实验实施阶段调整为从不同的组织获得体外可以长期增殖且保留分化潜能的视网膜前体细胞；同时，研究构建几十个包括IPO13在内的慢病毒载体，探讨这些基因在终末分化细胞向视网膜神经细胞分化中的作用及可能机制。本课题就上述问题进行了以下研究：探讨以人成体视网膜为来源进行视网膜前体细胞体外分离扩增的可能性及方法；探讨以胎儿视网膜为来源进行视网膜前体细胞体外分离扩增的方法优化；探讨应用视网膜发育阶段中的重要转录因子进行视网膜色素上皮细胞（RPE）向视网膜神经细胞再程序化的可能性。研究结果表明：成人视网膜体外分离培养可以获得具有一定时期内体外扩增能力的细胞，这些细胞表达nestin、 Sox2 和 Pax6在内神经干细胞表面标志物，并表达IPO13，并具有向一定的向神经视网膜内不同类型细胞分化的潜力，但这些细胞暂时无法分化为成熟的视网膜神经细胞；人胎儿视网膜前体细胞在低氧低糖环境下具有体外持续扩增能力及部分诱导分化能力，这些细胞甚至在一定条件下可形成胚胎干细胞样细胞并表达相应标志物如Oct4；应用p53的shRNA可以提高其他转录因子的感染效率，部分转录因子组合可以在RPE中出现神经细胞样形态变化，视网膜神经细胞相关基因的蛋白及RNA水平上调。目前相关研究已经获得阶段性成果，进一步实验可为理解IPO13等因子对于视网膜细胞命运决定的影响及其可能机制提供帮助。