蛋白酪氨酸磷酸酶受体G（PTPRG）在肝癌发生发展中的作用及机制研究

Hepatocellular carcinoma (HCC) is the second-most lethal cancer worldwide (also in China) and therefore a major public health challenge. Understanding the biology of HCC initiation and metastasis is important for developing better HCC diagnosis and treatment and improving patients’ prognosis. Our target sequencing of 283 cancer-related genes in 497 Chinese HCC tumor tissues revealed that the gene encoding protein tyrosine phosphatase receptor G (PTPRG) is frequently mutated. PTPRG is a transmembrane protein and mutation of this gene has not been identified previously in HCC. By further examination of the PTPRG mutation pattern, we found that most of PTPRG mutations occurs within inactive protein tyrosine phosphatase (PTP) domain D2 (PTPD2), not within catalytically active PTP domain D1 (PTPD1). Moreover, some of these mutations are recurrent. Previous structural study has suggested that PTPD2 of one PTPRG molecule can dimerize with PTPD1 of the other PTPRG molecule in a head-to-toe manner to block the active Cysteine site of PTPD1 when two PTPRG molecules are in close proximity. In addition, we found that PTPRG was overexpressed in HCC tissues compared with paracancerous tissues, and the vitro experiment indicated that the over-expression of PTPRG in HCC cell lines could significantly enhance the migration ability of cancer cells. We therefore hypothesize that PTPRG may function as an oncogenic PTP in HCC and mutations of PTPRG, particularly those in PTPD2, may prevent dimerization of PTPRG, allowing aberrant activation of PTPRG to promote oncogenic transformation of hepatocytes. To test this hypothesis, we will: 1) Analyze the oncogenic or tumor suppressive function of PTPRG in HCC cell lines; 2) Identify the oncogenic or tumor suppressive function of PTPRG using HCC xenograft mouse models and primary HCC mouse models; 3) Elucidate the molecular mechanism underlying PTPRG function in HCC. Completion of this study will not only shield light on the molecular pathogenesis of HCC, but also provide a new target for development of an effective biomarker and therapeutics for HCC.

肝癌是我国及全球第二大癌症死因，对其致病机制的理解是改善肝癌诊疗及预后的关键。项目组通过中国人群肝癌样本靶向捕获测序发现蛋白酪氨酸磷酸酶受体G（PTPRG）是一个新的肝癌高频突变基因，且突变主要集中在其无催化活性的结构域PTPD2，而不是在有催化活性的结构域PTPD1。根据PTPRG晶体结构，结合其在肝癌组织中的高表达现象和过表达PTPRG促进肝癌细胞迁徙能力的发现，我们推测PTPRG是一个潜在的新的肝癌驱动基因，且很可能是原癌基因，其异常将引起蛋白酪氨酸磷酸化不平衡，致使肝癌形成。为验证该假说，项目组将利用细胞和动物模型及临床标本，结合分子生物学、细胞生物学、生物化学及CRISPR基因编辑技术，系统研究PTPRG在肝癌发生发展中的作用及分子机制。这是一项创新性的研究探索，具有良好的研究基础和积累，研究结果将有助于进一步揭示肝癌的致病机制，为开发肝癌新生物标志物和靶向新药提供理论依据。

肝癌是我国常见恶性肿瘤之一，其死亡率在恶性肿瘤中居第三位。因此,探寻肝癌的相关发病机制可有助于进一步筛查肝癌高风险的患者,并且指导开发新的肿瘤干预及治疗策略。最近，课题组通过大批量中国人群肝癌样本靶向捕获测序发现一个新的高频突变基因蛋白酪氨酸磷酸酶受体G（PTPRG），且通过该基因在肝癌发生发展机制研究中取得了阶段性成果，我们的研究结果表明：在肝癌中，PTPRG主要通过①使FAK去磷酸化，抑制下游PI3K/AKT通路，②上游转录因子CEBPB结合其启动子，发挥抑癌作用，抑制肝癌转移侵袭。本项目首先在TCGA及本院人群数据中明确PTPRG在肝癌细胞中低表达，随后利用WB、qPCR和免疫组化技术进行验证，且明确PTPRG表达与肝癌预后呈负相关。然后，本课题组通过CRISPR/Cas9技术和慢病毒感染技术构建PTPRG敲除和过表达细胞系研究PTPRG对肝癌细胞系相关生物学行为的影响。在体内外实验中，我们通过划痕、migration、invasion和脾注射肝转移实验发现敲除PTPRG明显增加了肝癌细胞系的侵袭转移能力。为了进一步研究产生这种作用的机制，我们对PTPRG敲除细胞系进行了转录组测序，并从中筛选了部分表达改变明显的基因和相关信号通路。为了确保该转录组测序的可靠性，相关基因表达的改变在敲除和过表达细胞系中均做了进一步验证。随后通过免疫共沉淀、免疫荧光实验我们发现PTPRG-FAK结合。为了进一步在体内外试验中证明这种作用，课题组使用FAK抑制剂进行体内外实验研究发现FAK抑制剂可以明显抑制PTPRG敲除引起的高侵袭转移。由于课题组前期发现PTPRG在我国肝癌人群中存在高频突变，那么其是否会通过影响与FAK的结合，异常激活下游信号通路，导致肝癌进展值得我们进一步研究。课题组通过构建PTPRG点突变细胞株，发现突变后的PTPRG通过减少与FAK的结合抑制肝癌细胞的侵袭转移。对于PTPRG的上游调控，课题组利用JASPAR预测并锁定上游转录因子CEBPB，通过WB、ChIP、qPCR和免疫组化技术最终明确CEBPB对PTPRG的调控。综上所述，本课题组发现了一个新的肝癌抑癌基因，并且深入研究其促进肝癌发生发展的分子机制，可为肝癌研究提供较为有意义的借鉴。