类芽孢杆菌中固氮酶电子传递途径的鉴定和功能分析

The reduction of N2 to two ammonium molecules by nitrogenase requires eight electrons and eight protons. Thus, the electron transport pathway to nitrogenase plays a very important role in nitrogen fixation. Generally, oxidoreductase generates electrons by degrading carbohydrate and then flavodoxin or ferredoxin mediates electron to nitrogenase. However, the electron transport pathway in N2-fixing Paenibacillus is unknown. Our previous studies on a global transcriptional profiling analysis of Paenibacillus polymyxa WLY78 demonstrated that some genes encoding electron transporters were highly up-regulated in N2-fixing condition compared to non-N2-fixing condition. Furthermore, we demonstrated that fer and fldA encoding flavodoxin, and pfoAB encoding pyruvate-ferredoxin oxidoreductase could enhance the nitrogenase activity of the recombinant Escherichia coli 78-7 which carries a nif gene cluster (nifBHDKENXhesAnifV) of P. polymyxa WLY78. However, we do not know whether the flavodoxin encoded by fer or fldA is the direct electron donor to nitrogenase and whether the pyruvate-ferredoxin oxidoreductase encoded by pfoAB generates specifically electron for nitrogenase. Also, the genes yqiG,yqjM3,yqjM5 and ywcH3（encoding NADH:flavin oxidoreductases）and flr (encoding flavodoxin) were highly expressed in N2-fixing condition compared to non-N2-fixing condition, but their roles in the electron transports to nitrogenase need to be determined. In this study, the functions of the above-described genes in the electron transports to nitrogenase will be determined. This study will help us to find which gene(s) encoding flavodoxin or ferredoxin is (are) electron donor for nitrogenase and which gene(s) encoding pyruvate-ferredoxin oxidoreductase or NADH:flavin oxidoreductases generates electron for nitrogenase. The results will be of great use in enhancing nitrogen efficiency and transferring non-N2-fixing organisms into N2-fixing organisms.

电子传递在生物固氮过程中起着非常重要作用。但类芽孢杆菌中固氮酶的电子传递途径尚不清楚。我们通过转录组学发现一些电子传递基因在固氮条件下表达显著上调，其中fer和fldA（编码黄素氧还蛋白）及pfoAB（编码丙酮酸:铁氧化还原酶）能提高重组大肠杆菌78-7（携带类芽孢杆菌固氮基因簇nifBHDKENXhesAnifV）的固氮酶活性。但fldA和fer编码的黄素氧还蛋白是固氮酶的直接电子供体吗？pfoAB编码的丙酮酸:铁氧化还原酶直接为固氮酶产生电子吗？在固氮条件下表达显著上调的flr（黄素氧蛋白）及yqjM3、yqjM5、yqiG（NADH:黄素氧化还原酶）在固氮酶的电子传递中有什么功能呢？是否还有更能提高固氮效率的电子传递基因呢？有几个电子传递途径呢？本项目拟通过基因突变、电子传递功能鉴定等，阐明类芽孢杆菌中固氮酶的电子传递途径，研究结果对提高固氮效率、扩大宿主范围等都具有重要意义。

研究背景：电子传递在生物固氮过程中起着非常重要作用。在固氮菌中，氧还蛋白还原酶分解底物产生电子，然后铁氧还蛋白或黄素氧还蛋白作为固氮酶的直接电子供体将电子传递给固氮酶，将N2还原成氨。在模式菌株---产酸克氏杆菌（Klebsiella oxytoca）中，nifF 和nifJ是固氮酶的电子传递基因。nifJ 基因编码丙酮酸铁氧还原蛋白氧化还原酶 (pyruvate-ferredoxin oxidoreductase, PFOR)分解丙酮酸产生电子，由nifF基因编码的黄素氧还蛋白(flavodoxin, Fld)将电子直接传递给固氮酶。由于编码固氮酶特异的电子供体的基因在不同固氮菌中的同源性非常低（≤35%），导致固氮酶电子供体基因的鉴定困难，因此很多固氮菌中的电子传递途径和固氮酶的直接电子供体尚不清楚。. 研究结果：固氮类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）WLY78 基因组中没有电子传递基因 nifF 和 nifJ。本研究首先发现 P. polymyxa WLY78 在固氮条件下显著上调的 15 个电子传递基因分为两类, 一类基因编码固氮酶电子直接供体—— 黄素氧还蛋白 (flavodoxin, Fld) 或铁氧化还原蛋白 (ferredoxin, Fd), 另一类基因编码能够还原 Fd 或 Fld 的氧化还原酶。分别对着15个基因进性突变和固氮酶活性分析，发现cbiw 和 pfoApfoB 基因缺失突变株的活性分别比野生型下降了 31%和 36.7%。cbiw 基因编码一种 Fd 蛋白, pfoA 和 pfoB 基因共同编码丙酮酸铁氧还原蛋白氧化还原酶。异源回补实验表明 pfoA 和 pfoB 基因共同编码产物与 nifJ 编 码的PFOR具有相似的功能, 但cbiw基因不能被nifF基因替代。同时缺失cbiw和pfoA、 pfoB 三个基因后，突变株乙炔还原活性下降了 61%, 进一步证明 cbiw 和 pfoA、pfoB 均参与了固氮酶电子传递系统。cbiw基因编码的 Fd3411能够替代NifF或无机强还原剂二硫苏糖醇 (Dithiothreitol, DTT) 为固氮酶直接提供电子。cbiw 是一个新的固氮酶电子传递蛋白编码基因, pfoApfoB cbiw编码的Fd3411提供电子。另外还做了其他工作。发表SCI论文5篇。