DNA甲基化损伤剪切修复酶识别DNA中损伤位点动力学机制核磁共振探讨

DNA碱基损伤会导致DNA复制错误，从而改变组织细胞基因组稳定性，致肿瘤发生。在生物体系中，DNA碱基甲基化损伤剪切修复酶能够特异性识别DNA碱基甲基化损伤位点，使损伤位点碱基糖苷键水解断裂以被其他酶进一步修复。最近文献报导DNA糖基化酶UDG识别DNA损伤位点尿嘧啶时遵循"被动的单一分子机制"。该机制是否适用于DNA碱基甲基化损伤修复酶目前还不清楚。为此，本项目以DNA碱基甲基化剪切修复酶AAG、AlkA、AlkC和AlkD为代表，利用核磁共振技术研究包含损伤位点的特异性DNA分子和不包含损伤位点的非特异性DNA分子与这些DNA糖基化酶结合前后动力学变化，以考察DNA碱基甲基化损伤剪切酶识别DNA碱基序列中甲基化损伤位点时是否遵循"被动的单一分子机制"。

开展的工作和成果包含几个方面:1) 从公司合成两个TA10mer和GC10mer两个常规的非特异性DNA, 利用HPLC系统纯化了这两个DNA; NMR 动力学实验表明自由态DNA的动力学特征与已经报导的数据非常吻合； 2) 通过有机合成得到了糖环上2-位含有F的DNA碱基前体; 3) 开展了AlkC蛋白活性位点研究; 发现N208可能是活性位点； 同时也表明3-methyladenine不是理想的确定AlkC与DNA结合位点的底物；4）2012年一篇《Nature》文章报导了AlKD与不同DNA复合物的结构，阐述了AlkD识别甲基化损伤位点的机制，提出碱基甲基化会延长碱基对打开后状态的时间。这使得本项目原有的单独开展DNA动力学研究创新性减弱。因此，项目负责人临时对项目研究内容做适当调整，在继续开展DNA动力学研究的基础上，开展AlKC与DNA复合物结晶研究，得到了分辨率为2.6A的晶体，并在上海光源采集了三套数据，分别为：野生型的蛋白与DNA复合物的衍射数据，硒代的AlkC与DNA形成的复合物晶体的硒波长的SAD衍射数据，硒代的AlkC与DNA形成的复合物晶体的砷的波长的SAD衍射数据，目前正在进行结构解析。5) 两篇核心期刊论文被接受，两份与本项目有关的专利申请（专利申请号 201010611826.3以及201010611814.0）。