新型DNA糖基化酶AlkC识别损伤位点甲基化碱基结构与动力学基础研究

DNA damage can result in the errors of DNA replication, further leading to genome unstable, which is related to cancer generation. In biological systems, DNA glycosylases can specifically recognize DNA damage sites, and initiate base excision repair of N3- and N7- methylpurines from genome by catalysing hydrolysis of N-glycosidic bond, generate abasic sites in DNA that can ultimately lead to single- and double-strand breaks. AlkC and AlKD belong to a new superfamily of DNA glycosylases in three dimensional structures and functions. However, they're just distant homologs due to very low identities, and they work differently from each other in identification of DNA damage sites. Recent research indicates that AlkC has substrate specificity between TAG and AlKD. In this project, we will focus on two aspects: 1) the structural mechanism about how AlkC recognizes methylated damaged site by using X-ray crystallization techniques, and 2) the DNA dynamical basis about how AlkC catalyzes hydrolysis of N-glycosic bond in damage sites by using NMR methods, thus we can understand the structural and dynamical basis for AlkC to specifically recognize the damged site methylated base in dsDNA.

DNA碱基损伤会导致DNA复制错误，改变组织细胞基因组稳定性，从而致肿瘤发生。在生物体系中，DNA碱基甲基化损伤剪切修复酶能够特异性识别DNA碱基甲基化损伤位点，使损伤位点碱基糖苷键水解断裂以被其他酶进一步修复。AlkC与AlkD属于同一超家族，是一类结构与功能新颖的DNA甲基化损伤修复糖基化酶。但彼此同源性很低，功能差异较大。在识别损伤位点机制上AlkC可能介于糖基化酶AlkD和TAG之间。本项目旨在利用X-单晶衍射技术开展AlkC识别DNA中损伤位点甲基化碱基的结构生物学基础研究，同时利用核磁共振技术开展在AlkC作用下DNA碱基对的动力学特征研究，以期从结构与动力学两方面阐述AlkC识别DNA中损伤位点甲基化碱基机制。

本项目研究内容为DNA糖基化酶AlkC结构与功能机制的初步研究。AlkC和同家族的AlkD蛋白都属于第六类新的DNA糖基化酶-ALK家族。其中AlkD对7-甲基鸟嘌呤底物有较高的剪切活性，其自由态及与dsDNA结合的复合物结构均已解析。AlkC表现出对3-甲基腺嘌呤底物的识别特异性。该蛋白分为AlkCα和AlkCβ两个进化枝，其中AlkCβ的C末端多了一段Ig-like结构域。2018年文献报道了AlkCβ蛋白与dsDNA的复合物结构，目前AlkCα蛋白无任何结构报道。申请人课题组开展了如下工作：（1）首先发现Bacillus cereus来源的AlkCα全长蛋白与DNA复合物结晶条件进行优化，发现AlkCα在晶体生长过程中会断裂，为此对其loop进行截短得到了AlkC-D5和AlkC-D7蛋白。通过圆二色谱实验、3-甲基腺嘌呤的结合实验以及荧光偏振实验说明对蛋白loop的截短不会改变其二级结构，也不会影响与酶切产物以及dsDNA的结合能力。（2）获得了截短体蛋白与G·T错配的dsDNA复合物晶体，收取了硒代SAD、MAD数据以及As、I重原子的衍射数据，但均因为反常信号较弱未解决相位问题，可能是由孪晶现象导致。（3）更换DNA序列、结晶温度以及蛋白突变等方法均未发现新的可以复现的结晶条件，这可能是由蛋白本身容易发生聚沉、沉淀而不易结晶导致的。（4）采集了[Eubacterium] yurii 来源的AlkCα蛋白与G·T错配dsDNA复合物的衍射数据，尝试了yurii-AlkC-L51M/L139M双突变硒代以及甲基氯化汞的重原子浸泡法，均发现反常信号较弱。（5）利用SWISS-model提出了Bacillus cereus AlkC与中间态类似物1aR-dsDNA的复合物结构模型，发现E127、R158和E161残基为3-甲基腺嘌呤的关键识别位点，结合其他生化数据，表明模型正确。这些研究结果已经投稿。(6) 通过本项目实施，发表标注项目基金号的SCI论文7篇，核心期刊论文1篇，1篇文章在投。培养博士3名，硕士3名。