荞麦芽中Ⅱ相酶诱导子的鉴定及诱导机理研究

Reactive oxygen species (ROS) is closely related to the occurrence and development of overproduction induced oxidative stress and chronic diseases, the phaseⅡenzyme in the body of can effectively remove ROS and protect the body from damage. Buckwheat is a traditional Chinese medicinal and edible plant. It has the function of complex and extensive biological activities. Functional components and biological activity of buckwheat sprout are greatly improved when germinated from buckwheat. Previous study found that extract of buckwheat sprout can decrease cell injury induced by the oxidation and increase the quinone oxidoreductase (NQO1) activity. Therefore, we hypothesized that buckwheat sprout could induce the increase of phaseⅡenzyme activity. Therefore, this topic study in buckwheat malt as raw materials, screening of compounds can be induced by enzyme II from buckwheat (P Ⅱ EBS), using TLC, HPLC-MS, 1H-NMR and 13C-NMR and other means of identification of its structure; through the establishment of oxidative cell injury model, using Real-time PCR, Western blotting, laser confocal, Luciferase Report System Technology and method, the effects of P Ⅱ EBS on oxidative stress state of phase II enzymes, and to clarify the effect mechanism, provide a scientific basis for the development of functional food of buckwheat sprout.

活性氧自由基（ROS）过量产生引起的氧化应激与各种慢性病的发生发展密切相关，机体内的Ⅱ相酶可有效清除ROS，保护机体免受损害。苦荞是我国传统的药食两用植物，具有复杂的功能成分和广泛的生物活性，苦荞萌发后的荞麦芽，功能成分和生物活性大大提高。前期研究发现，荞麦芽提取物可保护氧化诱导引起的细胞损伤，并能升高醌氧化还原酶（NQO1）的活性。因此，我们推测荞麦芽可诱导Ⅱ相酶的活性。因此，本课题以荞麦芽为原料，从荞麦中筛选能诱导Ⅱ相酶的化合物（PⅡEBS），运用TLC、HPLC-MS、1H-NMR和13C-NMR等手段对其结构进行鉴定；通过建立氧化应激细胞损伤模型，运用Real-time PCR、蛋白免疫印迹、激光共聚焦、荧光素酶报告系统等技术和手段，研究PⅡEBS对氧化应激状态下Ⅱ相酶的影响，并阐明影响机制，为开发荞麦芽功能食品提供科学依据。

活性氧自由基（ROS）过量产生引起的氧化应激与各种慢性病的发生发展密切相关，机体内的Ⅱ相酶可有效清除ROS，保护机体免受损害。苦荞是我国传统的药食两用植物，具有复杂的功能成分和广泛的生物活性，苦荞萌发后的荞麦芽，功能成分和生物活性大大提高。前期研究发现，荞麦芽提取物可保护氧化诱导引起的细胞损伤，并能升高醌氧化还原酶（NQO1）的活性。因此，我们推测荞麦芽可诱导Ⅱ相酶的活性。因此，本课题以荞麦芽为原料，从荞麦中筛选能诱导Ⅱ相酶的化合物（PⅡEBS），研究PⅡEBS对氧化应激状态下Ⅱ相酶的影响，并阐明影响机制，为开发荞麦芽功能食品提供科学依据。.以醌氧化还原酶(NQO1)的诱导活性为导向，通过乙醇提取、有机溶剂逐级萃取、柱层析和薄层层析等手段从荞麦芽中分离和制备了Ⅱ相酶诱导子，并结合HPLC，HPLC-MS、核磁共振等手段，对分离的Ⅱ相酶诱导子进行了鉴定，研究发现，荞麦芽中的芦丁、槲皮素、绿原酸均可诱导肝癌细胞NQO1活性的升高，是荞麦芽中主要的Ⅱ项酶诱导子。建立了过氧化氢诱导氧化损伤肝癌细胞模型，研究发现，200uM的过氧化氢作用肝癌细胞3h，细胞活力、细胞中的总蛋白含量、主要抗氧化酶和Ⅱ项酶的活性降低为对照的50%左右。研究了荞麦芽乙醇粗提物、槲皮素、绿原酸、芦丁对正常和过氧化氢诱导氧化损伤肝癌细胞的细胞活力、抗氧化酶和Ⅱ相酶NQO1和HO-1活性，及NQO1 mRNA、HO-1 mRNA、Nrf2 mRNA水平及蛋白表达的影响，研究发现，荞麦芽中的槲皮素和绿原酸可抑制过氧化氢诱发氧化损伤肝癌细胞中主要抗氧化酶和Ⅱ相酶NQO1和HO-1活性的降低，并上调NQO1 mRNA、HO-1 mRNA、Nrf2 mRNA的表达水平及蛋白表达水平，阐明了荞麦芽及其主要组分槲皮素和绿原酸对氧化损伤的保护机制是通过Keapl-Nrf2-ARE信号通路上调抗氧化酶和Ⅱ相酶的活性。D-半乳糖诱发小鼠氧化损伤模型，分析测定了荞麦芽和绿原酸的保护作用，研究发现，荞麦芽、绿原酸可提高氧化损伤小鼠的脏器指数、主要抗氧化酶及Ⅱ相酶活性、mRNA和蛋白表达水平，验证了荞麦芽及其Ⅱ项酶诱导子的保护作用和保护机制。