基于全基因组SNP芯片结果在猪1号和15号候选染色体区域发掘鉴定猪锁肛致病基因

猪锁肛是一种由直肠先天发育不良导致的遗传缺陷，在养猪业中造成的危害不容忽视。为了解该病的遗传背景，发掘和鉴定猪锁肛致病基因，本实验室在前期研究中采用SNP芯片对锁肛猪和其表型正常的父母进行了全基因组扫描，并通过全基因组关联分析将锁肛致病候选基因锁定在1号染色体（约3Mb）和15号染色体（约2.4Mb）上。本研究拟对这两个区域内锁肛致病候选基因进行筛选，并对其功能进行系统研究。结合染色体区域测序技术对重要SNP进行筛查和性状关联分析，筛选致病候选基因。通过生物信息学预测以及基于分子水平和细胞水平的基因功能研究，包括比较候选基因在正常猪胚和锁肛猪胚发育过程中的组织定位、转录调控以及蛋白表达等方面的差异，进而鉴定其对锁肛遗传缺陷的作用。本研究筛选到的候选基因或突变位点可以用作种猪锁肛致病基因携带者的早期诊断和分子选择标记，提高选种效率。其次，本研究结果还可为人类锁肛疾病的研究提供一定的参考资料。

本研究利用猪SNP60芯片和RAD-seq技术对锁肛猪（n=27）及其表型正常的全同胞和父母（n=18）进行全基因组范围的SNP检测和分型，采用多种模型进行全基因组性状关联分析并结合候选基因法在长白和大白猪群中筛选锁肛致病候选区域（基因），并在锁肛猪和正常猪中对候选基因的突变、转录本和基因表达情况进行了初步研究。得到的结果如下：（1）利用SNP芯片在猪1号和15号染色体得到显著信号，并锁定ANKRD6和FN1两个候选基因；利用RAD-seq技术检测到247715个SNPs，并在1、2、5、6、14和16号染色体上获得与锁肛性状显著关联的SNP信号；利用候选基因法选择了GLI2、GLI3、BMP4、GREM、HOXD13、HOXB9和HOXB5共7个基因做进一步研究；（2）在锁肛猪、锁肛猪全同胞和正常猪DNA池中利用PCR扩增后直接测序法对以上基因的外显子突变进行筛查，发现ANKRD6、GLI3、BMP4和GREM基因序列十分保守，但FN1和GLI2基因编码区具有大量的SNPs，其中部分SNP改变氨基酸序列，且基因频率在锁肛猪和正常猪中存在显著差异；（3）获得了FN1、GLI2和GLI3基因全长cDNA序列，发现FN1基因在多个组织中呈现稳定的高表达，其外显子22、25 和33可发生选择性剪切，获得ANKRD6基因部分cDNA序列，且发现该基因具有多个转录本；（4）在锁肛猪和正常猪的直肠组织中对FN1、GLI2和GLI3基因的表达量进行检测，发现GLI2和GLI3基因在锁肛猪中的表达量显著高于正常猪的，而FN1基因的表达量没有显著差异；（5）获得GLI3基因启动子上游区域7个多态位点，预测了调控该基因的5个miRNAs。