诱导型启动子BjC-p真菌诱导元件的鉴定及功能分析

转基因植物产业的长远高效发展，需要多元化的启动子及启动子中重要调控元件的鉴定和利用。含双元CBD的芥菜新型几丁质酶基因BjCHI1无本底表达，但受MeJA、真菌的强烈诱导表达，暗示其启动子含有相应的诱导顺式作用元件。在前一项国家自然基金资助下，我们分离克隆具有自主知识产权的BjCHI1基因的启动子BjC-p，证明其受MeJA的强烈诱导并鉴定出应答JA信号的关键调控序列。近期实验已证明BjC-p受葡萄灰霉病等病原真菌的强烈诱导表达。本项目拟通过DNA置换、删减、定点突变等关键技术，详细分析BjC-p中响应真菌诱导的核心元件，并通过酵母单杂交、凝胶阻滞、染色质免疫沉淀等技术筛选鉴定与核心元件互作的转录因子，进而通过瞬时表达等技术详细分析BjC-p在对真菌诱导反应过程中的调控作用。这对BjC-p启动子表达调控机制的阐明及其在转基因作物中外源基因表达调控上的合理应用，具有重要的理论和实践意义。

转基因植物产业的长远高效发展，需要多元化的启动子及启动子中重要调控元件的鉴定和利用。含双元几丁质结合域的芥菜新型几丁质酶基因BjCHI1无本底表达，但受茉莉酸甲酯（MeJA）、真菌的强烈诱导表达，暗示其启动子含有相应的诱导顺式作用元件。在前一项国家自然科学基金资助下，我们分离克隆了具有自主知识产权的BjCHI1基因的启动子BjC-P。本项目证明BjC-P受葡萄灰霉病原真菌的强烈诱导表达，并通过DNA置换、删减、定点突变等关键技术，鉴定出BjC-P中响应真菌诱导的核心元件，即BjC-P中6个W-box-like元件中的其中一个元件W-box-like-4元件（GTAGTGACTCAT）。此结果揭示出W-box-like元件参与植物抗病反应的新的调节机制。以含有此核心元件的BjC-P野生型序列及突变序列为诱饵，通过酵母单杂交技术从芥菜cDNA文库中筛选出和该核心元件互作的蛋白，对筛选出的Bj13、Bj26和Bj39蛋白深入研究。生物信息学分析表明Bj13和Bj39为MYB类转录因子，Bj26为C2H2型锌指蛋白。凝胶阻滞实验及烟草瞬时表达实验进一步证明这3个蛋白通过与W-box-like-4元件特异互作，激活启动子BjC-P的活性。RT-PCR结果显示其在真菌诱导下表达量明显增高。综合以上结果表明这3个蛋白通过和BjC-P中的W-box-like-4元件特异结合，激活BjC-P活性，进而介导BjC-P真菌诱导响应并参与植物抗真菌病原菌的调控过程。这些结果为深入阐明BjC-P启动子介导抗病反应的表达调控路径及其在转基因作物中外源基因表达调控上的合理应用提供了重要的实验证据，也为进一步研究MYB类转录因子和C2H2型锌指蛋白在其他作物的病虫害防御作用及应用提供了实验依据。