柑橘抗冻进程中组蛋白H2B氧化修饰的分子基础研究

Biochemical studies of histone proteins have shown that they can be extensively modified through the addition of acetyl, methyl, phosphoryl, and so on. And these modifications can have major effects on the structure of chromatin and therefore may regulate gene expression. Oxidative modification of histone H2B is a newly discovered significant mechanism of histone modification. Our previous work showed that histone H2B oxidative modification occurred and mediated citrus's freezing resistant during cold acclimation. However, the molecular mechanism of oxidative modification is unclear..In this project, we focus on protein profile involved in oxidative modification of H2B. Firstly, we screen the proteins interacted with H2B by Co- immunoprecipitation. Secondly, we analyze protein sample by iTRAQ quantitative proteomic coupl ed with LC-MS/MS. At last, through bioinformatics method, to analyze, screen and isolate key genes related to oxidative modification of H2B, and identify these genes via gene-clone, expression validation and functional analysis in order to unclose the molecular foundation of histone H2B oxidative modification..This project can identify and clone the key genes related to oxidative modification of citrus H2B which will lay a foundation to analyze the molecular mechanism by which citrus response to freezing resistant mediated by H2B oxidative modification.

生化研究表明，组蛋白存在乙酰化、甲基化、磷酸化等多种修饰，这些修饰可调整染色质结构，从而调控基因表达。H2B的氧化修饰是一种新发现的组蛋白修饰方式。我们的前期研究表明，在冷驯化过程中，柑橘组蛋白H2B会发生氧化修饰，这种氧化修饰介导了柑橘的抗冻反应。但目前组蛋白的氧化修饰机理尚不清楚。.本项目拟选择介导氧化修饰的蛋白为中心，应用免疫共沉淀技术（Co-IP）获取与H2B互作的蛋白，再应用iTRAQ标记结合LC-MS/MS分析蛋白样品，结合生物信息学分析筛选和分离氧化修饰相关的关键基因，通过基因克隆、表达验证及功能分析予以确认，从而鉴定组蛋白H2B氧化修饰关键基因，解析组蛋白H2B氧化修饰的分子基础。. 本项目的完成可鉴定和克隆柑橘H2B氧化修饰关键基因，为培育抗冻农作物品种的分子育种提供新基因，为解析H2B氧化修饰介导的抗冻反应的分子机理奠定基础，对探讨抗冻转录调控机制具有重要意义。

生化研究表明，组蛋白存在乙酰化、甲基化、磷酸化等多种修饰，这些修饰可调整染色质结构，从而调控基因表达。H2B的氧化修饰是一种新发现的组蛋白修饰方式。我们的前期研究表明，在冷驯化过程中，柑橘组蛋白H2B会发生氧化修饰，这种氧化修饰介导了柑橘的抗冻反应。但目前组蛋白的氧化修饰机理尚不清楚。.本项目选择介导氧化修饰的蛋白为中心，应用免疫共沉淀技术（Co-IP）获取与H2B互作的蛋白，再应用LC-MS/MS分析蛋白样品，鉴定到碳酸酐酶、钙依赖型蛋白激酶以及5种功能未知的蛋白质：miraculin-like protein 2 [Citrus jambhiri]（命名为MLP2-1）；miraculin-like protein [Citrus x paradisi]；miraculin-like protein 2 [Citrus jambhiri]； putative miraculin-like protein 2 [Citrus hybrid cultivar]； predicted protein [Populus trichocarpa]。应用荧光定量PCR技术测定MLP2-1基因在冷驯化进程中的表达量，在0~6h内MLP2-1基因表达量有所提高，到12 h则表达量微微下降，在16 ~24 h，其表达量逐渐稳步升高。结合生物信息学分析选取MLP2-1基因进行克隆，得到712bp的片段，再与p1300M构建植物表达载体，并成功转入拟南芥。基因功能分析结果表明MLP2-1基因增强了拟南芥的抗冻性并增加了H2B氧化修饰百分率，说明MLP2-1基因是柑橘抗冻进程中组蛋白H2B氧化修饰的分子之一。.本项目鉴定和克隆了柑橘H2B氧化修饰关键基因——MLP2-1基因，为培育抗冻农作物品种的分子育种提供新基因，为解析H2B氧化修饰介导的抗冻反应的分子机理奠定基础，对探讨抗冻转录调控机制具有重要意义。