去泛素化酶USP46在狼疮性肾炎足细胞凋亡中的作用及机制

Systemic lupus erythematosus (SLE) is a systemic autoimmune disease characterized by generation of autoantibodies particularly against components in the cell nucleus. Lupus nephritis (LN) is one of the most serious complications of SLE and is associated with high rates of morbidity and mortality. The dysfunction of podocyte plays an important role in the pathogenesis of lupus nephritis. However, the exact mechanism is unknown. Recently, many studies reported that Ubiquitin proteasome pathway was involved in the pathogenesis of LN. Our previous study found that not only ubiquitin-specific protease 46 (USP46) mRNA expression in peripheral blood of patients with LN was significantly higher than healthy controls, but also the protein expression levels of USP46 in the patients’ kidney also increased. Moreover, USP46 located in podocyte, and associated with podocyte apoptosis. Pervious study reported that tumor suppressor gene PHLPP1 is a target protein of USP46. So, we assume that "USP46 regulates PHLPP1 via the ubiquitin-proteasome pathway to promote podocyte apoptosis, which is associated with the development of LN.". In this study, we conceived to detect the expression of USP46 in blood and Renal biopsy specimen of patients with lupus nephritis; and establish the model of LN in cellular level to investigate the role and molecular mechanism of USP46 in podocytes apoptosis. Moreover, by using animal models of MRL/faslpr mice (LN animal model), we try to validate the mechanism of USP46 in renal injury and to study the effect of intervention of USP46 on the kidney morphology and function, in order to provide new clues for revealing the pathogenesis of lupus nephritis and drug development.

狼疮性肾炎(LN)是系统性红斑狼疮最常见且最严重的并发症，足细胞损伤在LN发病中发挥重要作用。我们发现去泛素化酶Usp46在LN患者外周血中mRNA水平显著高于健康人，肾脏中该蛋白也明显增加，而且定位于足细胞，与足细胞凋亡有关，但是分子机制仍不清楚。研究表明抑癌基因PHLPP1是USP46的底物蛋白，由此我们推测“USP46通过泛素-蛋白酶体通路调控其靶蛋白PHLPP1，促进足细胞的凋亡，与LN的发生发展有关”。本研究拟从三方面研究:1)检测狼疮性肾炎患者体内USP46的表达及其与肾脏损伤之间的关联，探讨其在LN患者疾病进展和预后中的作用; 2)研究足细胞中USP46对PHLPP1的调控作用及分子机制，明确其在足细胞凋亡中的作用；3)运用狼疮鼠动物模型，验证USP46在LN肾损伤中的作用机制并研究干预对于肾脏形态和功能的改善及足细胞的影响，为揭示狼疮性肾炎的发病机制及药物研发提供新的线索。

足细胞损伤在狼疮性肾炎发病中发挥重要作用，尤其与蛋白尿的产生密切相关。泛素-蛋白酶体通路是否参与其中仍不十分清楚，本研究采用人群、体外细胞学实验和体内动物实验相结合的方式探索了去泛素化酶USP46在足细胞损伤中的作用及机制，结果发现：1）狼疮性肾炎（LN）患者外周血中Usp46 mRNA的表达水平显著高于健康对照人群，LN患者肾小球足细胞中USP46蛋白表达增高，与患者24h尿蛋白呈正相关，与足细胞标志蛋白Podocin负相关，说明USP46可能与蛋白尿的产生有关。2）发现USP46参与LN患者置换血浆介导的人足细胞（HPCs）损伤及线粒体功能障碍。LN患者置换血浆(LN plasma)刺激48h后，USP46表达显著升高，而且其主要定位于HPCs线粒体中。在HPCs中高表达USP46，加重了LN plasma引起的足细胞损伤及线粒体功能障碍：与转染对照质粒组相比，高表达USP46质粒组足细胞标志蛋白Podocin表达明显降低；COXⅣ蛋白（代表线粒体生成）表达明显降低；线粒体ATP生成减少；ROS产生减少。3）发现USP46通过泛素-蛋白酶体通路调控足细胞中PHLPP1的稳定性来发挥作用。LN plasma刺激HPCs 48h后，PHLPP1蛋白表达水平较对照组显著升高，与USP46共定位，且PHLPP1泛素化水平下降；免疫共沉淀结果显示HPCs中USP46能够与PHLPP1直接结合；USP46调控PHLPP1的泛素化降解，即高表达USP46后，PHLPP1通过泛素-蛋白酶体通路降解减少，而且这一作用受USP46去泛素化酶活性影响。4） 敲低足细胞中USP46的表达水平可显著改善LN患者置换血浆介导的HPCs足细胞损伤及线粒体功能障碍。与敲低对照组相比，敲低USP46组Podocin和Nephrin表达均明显增加。敲低组COXⅣ蛋白表达明显增加，线粒体ATP生成增多，ROS产生增多，JC-1染色激光共聚焦结果显示，敲低USP46后，红色荧光/绿色荧光比值有所升高，线粒体膜电位升高。5）MRL/faslpr狼疮鼠体内抑制USP46的表达可部分缓解狼疮鼠肾脏损伤。本研究明确了去泛素化酶USP46在足细胞损伤中的作用及机制，为寻找LN早发现、早诊断的生物标记物，了解LN的发病机制，尤其是足细胞损伤的分子机制及新型药物的研发奠定基础。