家蚕细小病毒样病毒BmPLV-Z DNA聚合酶的功能研究

本课题组首先完成了家蚕细小病毒样病毒基因组全序列，发现了BmPLV-Z ORF4编码一个由1115个氨基酸组成的蛋白，理论分子量预计为128.3KD，通过对该蛋白与PDB数据库进行blast，结果发现该蛋白含有DNA pol B家族的一个保守区域，推测该蛋白为病毒自身编码的DNA聚合酶，在病毒复制中起着重要的作用。因此，本项目拟开展（1）BmPLV-Z编码的DNA聚合酶活性分析；（2）DNA聚合酶催化活性位点的鉴定；（3）宿主聚合酶与病毒DNA聚合酶之间的关系；（4）DNA聚合酶的互作蛋白的鉴定和功能研究。通过该项研究可揭示病毒DNA聚合酶的催化活性、宿主聚合酶与病毒DNA聚合酶之间的关系，最终明确该酶在病毒DNA复制过程中的功能，为该DNA聚合酶的分类、探明家蚕细小病毒样病毒的复制机理提供理论依据。

家蚕二分浓核病毒特异性地感染家蚕中肠细胞，该病毒由VD1和VD2两个单链DNA分子组成，其中VD1基因组中含有一个大的ORF4，序列比对结果预示VD1- ORF4编码的蛋白在病毒复制和增值过程中起着重要的作用，其具体功能未知。在本项目研究中，我们揭示了VD1- ORF4的转录起始位点和转录终止位点，制备了针对VD1- ORF4理论氨基酸序列不同抗原表位的三种多克隆抗体，进而揭示了VD1-ORF4在病毒感染的家蚕中肠组织中编码多个蛋白，其中证实了VD1- ORF4编码一个127 kDa的大蛋白和一个53 kDa的病毒结构蛋白；另外，还有几个蛋白有待于进一步证实；亚细胞定位和免疫组化实验结果表明VD1-ORF4编码的蛋白主要出现在病毒感染晚期，并且能够进入细胞核发挥作用，表明VD1- ORF4编码的蛋白可能参与了病毒复制与增值。构建了快速表达外源基因的真核表达系统，证实了VD1- ORF4在该表达系统中不表达或者表达量极低，由此表明VD1- ORF4编码的蛋白性质特异；同时利用该表达系统快速表达了家蚕二分浓核病毒NS1蛋白，对纯化到的NS1蛋白进行质谱分析，发现该蛋白第191位苏氨酸位点残基上发生磷酸化修饰；ns1基因启动子活性研究结果表明：-236 nt到-206 nt间的30 个核苷酸序列是ns1启动子高活性的依赖序列，该启动子也是TATA-box非依赖性的启动子；构建了家蚕生物反应器快速表达家蚕二分浓核病毒NS1蛋白的平台体系。Co-IP实验结果揭示了161多种家蚕蛋白以及病毒蛋白与VD1- ORF4蛋白间发生相互作用，其具体作用有待下一步研究。