基于SIL-MFA的白酒发酵阶段氨基甲酸乙酯前体物质代谢网络分析

Ethyl carbamate (EC) is common potential carcinogens in alcoholic beverage by microorganisms. EC in Chinese spirits would affect the healthy development of Chinese spirits industry, so it is a problem to be settled urgently. The production of Chinese spirits is an opening fermentation process of mixed strains, which base on saccharification and fermentation concurrently. The factors effect of metabolism of the EC and its precursors are more complex than other alcoholic beverage which applying single strains. Metabolic mechanism of EC and its precursors in Chinese spirits can not be fully elucidated by formation mechanism of the other international alcoholic beverage, such as urea and amino acid. The metabolic mechanism of EC and its precursors is the first step to prevent and control EC content in Chinese spirits. Stable isotope-labeled metabolic flux analysis (SIL-MFA) is a quantifiable and effective method to reflect the microbial metabolic networks, so it is more suitable to research the complex metabolic flux of Chinese spirits than other methods. It would investigate the metabolic flux analysis theory in the process of fermentation of Chinese spirits using low abundance SIL-MFA technology from three aspects, (ⅰ)Screening and confirmation of the precursors of EC;(ⅱ) tracking of the key process and analysis of the influencing factors; (ⅲ) nitrogen metabolic flux analysis of mixed bacteria in spirits. All of these efforts aim at evelation of the metabolic mechanism of EC and its precursors, and provide theoretical support for how to prevent and control EC in Chinese spirits.

氨基甲酸乙酯（EC）是世界饮料酒中普遍存在由微生物代谢产生的内源性污染物，在我国白酒中亦具有极高的食品安全风险。然而由于白酒采用双边混合菌株开放式的发酵方式，国际上单菌种发酵酒的EC前体物质尿素、氨基酸生成途径理论，尚无法完全阐明白酒中EC前体物质的代谢途径。确证白酒EC前体物质生成机理与影响因素，是从根源上指导建立白酒EC控制措施的核心。稳定同位素示踪代谢流分析（SIL-MFA）作为研究微生物代谢网络的最新定量技术，比代谢平衡分析技术更适合研究白酒开放生产中的多菌种代谢。课题拟基于SIL-MFA技术在低丰度标记下，建立白酒酿造过程中EC前体物质的混合菌种代谢网络流量分析模型，结合白酒EC前体物质筛查确证、关键工艺跟踪及影响因素分析，全面揭示白酒EC前体物质代谢生成机理，为白酒EC的预防控制技术研究提供理论支撑。

氨基甲酸乙酯（EC）是世界饮料酒中普遍存在由微生物代谢产生的内源性污染物，在我国白酒中亦具有极高的食品安全风险。然而由于白酒采用双边混合菌株开放式的发酵方式，国际上单菌种发酵酒的EC前体物质尿素、氨基酸生成途径理论，尚无法完全阐明白酒中EC前体物质的代谢途径。确证白酒EC前体物质生成机理与影响因素，是从根源上指导建立白酒EC控制措施的核心。本项目系统分析并且阐明了我国白酒中EC生成机理与影响因素，白酒中EC主要在储存阶段产生，主要的前体物质为氢氰酸，氢氰酸浓度、储存时间、储存温度是影响白酒中EC含量水平的显著因素，光照也会促进白酒中EC的生成，铜离子可以催化氢氰酸和乙醇反应生成EC；项目跟踪分析了白酒生产过程中氰化物的变化趋势，证明整理环节为影响氰化物的关键步骤，氰化物来源于原料中的省糖苷分解，不同原料中氰化物含量差异较大，氰化物可通过浸泡和蒸煮减低，验证了蒸馏环节引入铜离子对氢氰酸降控原理与实际效果，大生产中减低效果可达35%。从生成、储存等方面给出了控制白酒中EC的建议措施。研究结果将为进一步控制白酒中EC含量，提升白酒中质量品质，降低白酒国际化进程中的技术壁垒等方面有着重要的意义。此外，项目组系统分析了稳定同位素代谢分析理论，构建了代谢网络与核心算法，在低浓度（1-13C）葡萄糖标记培养情况下酿酒酵母蛋白氨基酸中δ13C值，在0.5%的标记浓度下分析酿酒酵母中央代谢网络流量和氨基酸代谢网络，利用15N低浓度标记初步分析了微生物尿素代谢的基本网络结构，证明利用GC-C-IRMS技术可以在浓度标记下精确的分析微生物代谢网络流量，研究极大程度的节约了MFA的实验成本，为今后MFA的大规模进行或在传统发酵食品大生产中应用提供方法与技术支撑。