家蚕细小病毒样病毒非结构蛋白NS1的表达调控及靶分子识别

To the best of our knowledge, Bombyx mori parvo-like virus (BmPLV) is the unique virus which encodes a DNA polymerase and posses two linear single-strand DNAs, but the mechanisms of the virus gene expression and virus replication are unknown. Our previous research showed that the non-structrue protein NS1 combined multiple functions such as ATPase activity, helicase activity and site-specific binding to a DNA recognition motif, indicting that it plays a key role in the replication of virus DNA. However, the mode of the expressing regulation and the interacted target proteins of NS1 are unknown. In this project, following issues will be resolved in the future: (1) to analyze the promoter activity and translational mode of ns1 gene, (2) investigating the activity of promoter trans regulation of NS1, (3) determining the phosphorylation site of NS1 and the association between the phosphorylation and its function, (4) characterization of the target proteins interacting with NS1. As a key multifunctional protein closely involved in virus DNA replication, we expect that elucidating the mode of NS1 expressing regulation and the target proteins interacting with NS1 will help us to understand the mechanism of the gene expressing regulation and replication of virus.

家蚕细小病毒样病毒（Bombyx mori parvo-like virus, BmPLV）是目前已知的唯一一例自编码DNA聚合酶的单链线性DNA病毒，也是首例动物二分病毒，其基因表达调控及复制机理未明。我们的前期研究表明BmPLV-Z NS1 是一个多功能蛋白，具有ATPase活性、特定DNA序列结合以及helicase活性，预示该蛋白与病毒DNA复制密切相关。但NS1蛋白的表达调控模式和其相互作用的靶分子尚不清楚。本项目拟开展(1)ns1基因转录本及其启动子分析;(2) NS1蛋白转录激活功能分析;(3)分析NS1蛋白磷酸化及磷酸化与功能的关系;(4) NS1蛋白的互作蛋白的分离鉴定。作为与DNA复制密切相关的多功能蛋白，揭示NS1蛋白的表达调控特征及其在宿主细胞内相互作用的靶分子，对阐明BmPLV病毒的基因表达调控及复制机制具有重要意义。

BmBDV NS1蛋白具有特异DNA序列结合、ATP酶和解旋酶的活性，与病毒的复制密切相关，进一步研究NS1蛋白的表达调控及其功能对深入了解病毒复制及其与宿主的相互作用具有重要意义。在本研究中，我们发现ns1和ns2共转录，转录本大小为1148 nt，转录起始于ns2基因起始密码子上游21 nt，终止于ns1基因终止密码子下游13 nt，从感染后48 h开始能检测到转录本，基因的转录在感染后72 h达到最高水平。在这一转录区域未发现mRNA可变剪辑。直到感染后72 h和96 h才能在病毒感染的家蚕中肠中检测到NS1蛋白的表达。ns1基因启动子能在体外驱动报告基因的表达，基因组末端的共有序列不影响启动子活性，TATA框, CAGT框以及上游nt-205 到nt-236之间的区域对启动子的活性至关重要。同时我们还分析了次要结构蛋白P133基因的启动子，TATA box对该启动子基础的活性至关重要，在-204 nt至-159 nt间存在一个负调控元件，缺失该区域能极大地提高启动子活性(约7倍)，截短至-141 nt后，其活性又回到基础活性。NS1蛋白对结构蛋白启动子P21和P89有一定的激活作用，当共转染NS1蛋白时，P21启动子活性提高约30%，P89启动子活性提高15.5%。在BmBDV NS1氨基酸序列184位点上发生磷酸化，还有两个可能磷酸位点（181和191位点）。这些位点的苏氨酸发生突变后，其ATPase活性明显下降。通过免疫共沉淀技术在病毒感染的家蚕中肠中纯化到了NS1蛋白的互作复合体蛋白，质谱鉴定表明23个宿主蛋白与NS1互作有关。全面系统的研究了家蚕幼虫被病毒感染后的连续病理变化，阐明了病毒复制与组织病变和个体病变之间的密切联系。发现BmBDV基因组节段差异积累，这种基因组节段拷贝数的差异调控普遍存在于多分体病毒中，可能代表一种进化的优势。我们的研究为阐明BmBDV的复制机理、病毒与宿主间的相互作用以及在生产实践中防治该病毒打下了基础。