家蚕核型多角体病毒DNA聚合酶的复制功能研究

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)是杆状病毒的模式病毒之一，是导致我国夏秋季蚕茧减产的重要原因。我们在长期对BmNPV功能基因分析的基础上提出对该病毒的DNA聚合酶进行研究。BmNPV DNA聚合酶是一保守性很强的基因，含有各种真核生物和病毒DNA聚合酶的保守序列。BmNPV有其独特的复制模式，但长期以来，人们对杆状病毒DNA聚合酶在DNA复制过程中的功能了解不多。为了阐明该病毒的感染增殖的特性，本项目拟开展（1）病毒DNA复制相关因子的确定；（2）DNA聚合酶在主复制叉上DNA合成活性的鉴定；（3）跨损伤合成能力的分析。通过本研究以揭示该病毒的复制机制以及病毒与宿主之间的互作关系，为我国养蚕业的脓病防治、有效地利用该病毒作为生物防治提供理论参考。

家蚕核型多角体病毒(BmNPV)是杆状病毒的模式病毒之一，是导致我国夏秋季蚕茧减产的重要原因。生命有机体在生长繁殖过程中的一个主要事件就是遗传信息的传递，母代的遗传信息经过DNA的精确复制得以传递给子代，在此过程中DNA聚合酶发挥着重要作用。由 BmNPV 基因组orf53编码的家蚕核型多角体病毒DNA聚合酶（BmNPV-POL）就扮演着这一重要角色。目前国内外对BmNPV-POL的研究很少，一个关键的原因是得不到高纯度的目的蛋白。为了阐明该病毒的感染增殖的特性，本项目首先对该基因序列进行了密码子优化，用E.coli系统表达出BmNPV-POL蛋白。为了得到高酶活的BmNPV-POL蛋白，本研究又利用MultiBac杆状病毒-昆虫细胞表达系统来表达带His标签的融合蛋白。利用Superose 6分子筛确定了BmNPV-POL的分子量约为110KDa，在昆虫细胞内装配纯化出的目的蛋白是单体形式。用poly(dA)/oligo(dT)或者M13为模板考察BmNPV-POL 的 DNA 持续合成能力，均发现BmNPV-POL有很高的酶活。研究发现KCl和DMSO对BmNPV-POL蛋白有抑制作用。该酶对aphidicolin非常敏感，很少的剂量就使得酶活性急速下降。另外，本研究利用M13做模板检测目的蛋白的延伸活性，发现BmNPV-POL在复制过程中不依赖RFC，但SSB可以刺激BmNPV-POL的活性。这一结果为杆状病毒DNA复制机制的研究打下理论基础，也为由于BmNPV引起的家蚕脓病的生物防治以及用家蚕做生物反应器等商业应用提供基础。