人胚胎干细胞源性视网膜前体细胞的转录因子Sox1与Sox2调控及移植研究

人胚胎干细胞定向诱导分化及移植为难治性视网膜疾病，尤其是视网膜变性疾病的治疗带来了希望，但究竟将细胞诱导分化至哪一阶段、移植哪些种类细胞及细胞数量等问题仍有待解决。为此，我们从发育的源头开始，先应用免疫荧光及原位杂交技术对5-13周早期人胚胎视网膜发育过程中的转录因子表达进行研究，以期揭示转录因子表达的规律。在此基础上，采用已有的方法从人胚胎干细胞诱导出视网膜前体细胞，了解体外诱导视网膜前体细胞转录因子表达与在体表达的对应关系，并采用四环素调控的高表达外源基因的真核表达体系，对其中决定色素上皮细胞与感光细胞转化的关键转录因子（Sox1和Sox2）的调控机制进行研究，筛选出合适的分化细胞类型。进一步建立MNU诱导的视细胞损伤动物模型，通过比较不同分化阶段细胞、细胞数量及单一或联合色素上皮细胞与感光细胞前体细胞对受损视网膜的结构与功能修复的差别，为临床视网膜变性疾病的细胞移植治疗提供参考依据

虽然动物视网膜发育的研究资料已经基本完善，并且在动物视网膜发育过程中，很多基因的表达与人的视网膜相似，但目前仍缺乏对人胚胎视网膜发育过程中转录因子表达变化的系统研究。因此我们收集了4周至12周的药流人胚胎，应用免疫荧光技术，观察在人胚胎视网膜发育的不同时期，转录因子表达的变化。虽然我们的结果表明，在人胚胎视网膜的发育过程中，大多数转录因子的表达变化都与动物模式获得的资料相类似，但人胚胎视网膜在发育过程中仍有一些转录因子的表达是在动物上未看到的，其中主要是Sox1和Sox2在视杯外层的一过性表达。以往的研究表明，在动物视网膜发育过程中，Sox1和Sox2不会出现在视网膜的色素上皮层，Sox1在眼睛的发育过程中主要与晶状体的分化有关，而Sox2主要与神经视网膜的发育有关。但我们的结果清楚地显示，Sox1和Sox2在视杯的外层尚未形成黑色素时有强阳性表达。我们推测，二者在此时期的强阳性表达是为了启动视泡上皮向RPE前体细胞的分化。因此我们认为，Sox1和Sox2在人胚胎视网膜发育过程中可能是诱导RPE前体细胞分化的重要转录因子。另外我们还发现视网膜内的6种神经元可能来自于两大类细胞，一类是Chx10阳性的细胞，另一类是Pax6阳性的细胞。Chx10阳性的细胞可能主要分化为视锥细胞、视杆细胞和双极细胞，而Pax6阳性的细胞主要分化为节细胞、无长突细胞和水平细胞。视网膜退行性疾病，包括常见的年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration, AMD）和色素性视网膜炎(retinitis pigmentosa, RP)，主要累及的细胞包括视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium, RPE)和感光细胞。感光细胞的退行性病变会导致患者视力减退甚至失明。目前对于视网膜退行性疾病仍无有效药物进行治疗，因此，寻求新型疗法成为当务之急。人多能干细胞，包括人胚胎干细胞和人诱导的多能干细胞，具有分化的全能性，在特定条件下能定向分化为人体任何一种细胞，包括特定的神经元。这些人类神经细胞被进一步修饰后可用来研究神经退行性疾病的病理发生过程。除此之外，可以将其用于细胞替代治疗，从而达到治愈视网膜退行性疾病的目的。