一种罕见支链糖阿德加糖的生物合成机制研究及其应用

Many microbial drugs and biologically active secondary metabolites produced by microoganisms are frequently glycosylated and these sugar substituents play an important role in pharmacological activity. Changing and modifying the structures of the sugar moieties of these natural products by genetic engineering has become an important way to discover new microbial drugs. This approach requires a deep understanding the biosynthetic pathway of each sugar target in microoganisms. Aldgarose is an 8-carbon branched sugar that was only found in unusual aldgamycin-like 16-membered marolides. Thus far, its biosynthetic mechanisms are not elucidated. Recently, screening of antibiotics-producing streptomyces identified a novel strain producing a substantial amount of aldgamycin-like marolides. Until now, 8 new aldgamycin-like compounds were isolated from the strain and all their structures were determined, which should provide a fighting chance for elucidating the biosynthetic pathway of aldgarose. In this study, we first intend to determine the gene cluster for the biosynthesis of aldgamycin by adopting a transcriptome-mining strategy, and then elucidate the gene clusters related to the biosynthesis of aldgarose by bioinformatics analysis and in vivo genetic experiments. Finally, the elucidated biosynthetic pathway of aldgarose is applied in the glycoengineering of a clinically used macrolid antibiotic erythromycin. Our study would provide a new tool for the glycodiversification of natural products.

微生物药物及微生物活性代谢产物普遍含有多样的糖单元，糖基在它们的药理作用中发挥着重要作用。利用基因工程的手段，修饰或改变天然产物的糖基侧链已成为获得新的微生物药物的重要方法。而该方法成功运用的关键在于阐明各种糖基在微生物中的生物合成机制。阿德加糖是（aldgarose）一种罕见的八碳支链糖，只存在于阿德加霉素类大环内酯（迄今为止仅发现7个）中，其生物合成的机制一直未被阐明。最近，我们筛选得到一株富产阿德加霉素类大环内酯的放线菌，从中分离鉴定了5个新的阿德加霉素，这为研究阿德加糖的生物合成机制提供了难得的素材和宝贵机会。本项目拟以该菌株为研究对象，重点阐明阿德加糖的生物合成机制，首先克隆阿德加霉素生物合成的基因簇, 并通过生物信息学分析和体内遗传学试验，阐明阿德加糖的生物合成机制，并拟在红霉素的糖基侧链改造中进行初步应用。本研究将为微生物药物及微生物次生代谢产物的糖基多样化改造提供新的工具。

天然产物是新药发现的重要源泉，其化学结构中通常含有结构多样的糖单元，且糖基在它们发挥药理活性中至关重要。利用基因或代谢工程的手段，修饰或改变天然产物的糖基侧链已成为获取新活性天然产物的重要方法，而该方法成功运用的关键在于阐明各种糖基的生物合成机制。我们前期从一株海洋链霉菌中分离获得了两类大环内酯类抗生素，阿德加霉素和查尔霉素，二者仅在C5的糖基取代不同，前者为一种罕见的含有5元碳酸酯环结构的八碳支链糖“阿德加糖”，后者为“查尔糖”，关于这两种糖的生物合成机制均不清楚。. 本项目首先对该链霉菌的全基因组进行了测序，并通过生物信息分析找到了可能合成阿德加霉素或查尔霉素的基因簇。利用结合转移法，我们首先对基因簇中合成大环骨架的聚酮合酶（PKS）基因进行了敲除，结果发现敲除PKS后，阿德加霉素和查尔霉素都不再产生了，据此我们首次发现了阿德加霉素和查尔霉素来源于同一个基因簇。在此基础上，我们利用基因敲除和回补手段，首次确立了阿德加霉素生物合成基因簇的边界，该簇横跨77.7 kb，包含了35个基因。与以前报道的查尔霉素生物合成基因簇相比，阿德加霉素生物合成基因簇不仅包含了查尔霉素基因簇，还多出了10个功能未知基因（almC1，almUI，almUII，almUIII，almUIV，almUV，almDI，almDII，almDIII），推测其很可能与阿德加糖的生物合成相关。通过对这个10个基因进行敲除和回补，结合代谢产物分析，我们首次发现了阿德加霉素和查尔霉素生物合成的分叉点，即关键糖中间体TDP-3-keto-4,6-dideoxy-D-glucose在almC1的作用下发生3-羰基还原，从而引发查尔霉素的合成；而在almDI/almDII复合物的作用下3位引入二碳支链，转向合成阿德家霉素。进一步的研究发现almUI，almUII，almUIII，almUIV，almUV与阿德加糖中5元碳酸酯环的形成相关，这可能是自然界又一合成碳酸酯环的新机制。同时，我们还阐明了负责查尔糖3位甲基化的酶，这是首个能作用于4,6-二脱氧糖的TylF家族甲基化酶。. 本项目利用基因敲除和回补、底物喂养以及体外酶催化等多种手段，系统的阐明了阿德加糖和查尔糖的生物合成机制。本项目将为天然产物的糖基化改造提供了新的糖基工具，完成了项目制定的目标。