绿胶霉素类特殊类群甾体的生物合成途径研究

Viridins represented by wortmannin, viridin and demethoxyviridin are a unique class of steroids from fungi, which have shown important biological activities. It was demonstrated very early that they are biosynthesized as a branch of the ergosterol biosynthetic pathway, but the branch point and the biosynthetic logic after branch are still not clear. In our previous study, we have isolated demethoxyvridin and several key biosynthetic intermediates from Nodulisporium sp.. Based on these compounds, we hypothesized that the branch point of viridins and ergosterol biosynthesis occurs before or after 3-ketoreduction in the ergosterol biosynthetic pathway; and cleavage of C20-C22 is responsible for causing the branch, which is then followed by formation of 4,6-furan ring and other structural units. To verify our hypothesis, we have sequenced the whole genome and transcriptome of Nodulisporium sp., and screened out the genes involved in the biosynthesis of ergosterol and all the P450 genes possibly participating in the post-branch biosynthesis. In this project, we will investigate the functions of candidate genes by establishing efficient gene knock-out method based on CRISPR/Cas9 technology and the aspergillus oryzae heterologous expression system well established in our lab, and try to elucidate the biosynthetic pathway of demethoxyviridin, which will provide basic knowledge for understanding the biosynthetic pathways of all viridins and generation of new derivatives with similar structure by combinational biosynthesis.

以渥曼青霉素、绿胶霉素、去甲氧绿胶霉素为代表的绿胶霉素类化合物是一类含有特殊甾核结构且具有重要生物活性的真菌代谢产物。虽然人们早已证明它们是从麦角甾醇途径分支而来，但具体分支点以及此后的生物合成逻辑尚未明确。我们前期从一株多节孢属真菌分离到了去甲氧绿胶霉素及其生物合成的多个中间体。基于此，我们提出绿胶霉素类化合物的分支点发生在麦角甾醇途径的C3羰基还原前后；且C20-C22侧链断裂是引发分支的关键，随后才启动4,6呋喃环等结构单元的合成。由此我们对该菌的基因组和转录组进行了测序，并完成了麦角甾醇生物合成基因以及可能参与分支后反应所有P450酶的分析。本研究拟通过建立高效的CRISPR/Cas9基因敲除法，并利用本实验室成熟的米曲霉表达体系对候选基因进行验证，由此阐明去甲氧绿胶霉素的生物合成途径，为全面揭示绿胶霉素类化合物的生物合成途径及利用组合生物合成手段获取具有此类结构的衍生物奠定基础。

以渥曼青霉素、绿胶霉素、去甲氧绿胶霉素为代表的绿胶霉素类化合物是一类具有特殊4,6呋喃甾核结构且具有重要生物活性的真菌次生代谢产物，不仅具有广谱的抗真菌作用，还具有突出的抗肿瘤活性，其机制主要通过特异性地抑制磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）这一与肿瘤生长密切相关的信号分子。其中，渥曼青霉素作为经典的PI3K抑制剂，已广泛用于生物学研究，而且以其为原型开发的抗肿瘤药PX-886已经进入II期临床。我们前期的研究还发现绿胶霉素类化合物能显著改善老年痴呆（AD）果蝇的学习记忆能力和抑制A42的聚集，提示其有望开发成新的抗AD药物。因此，阐明绿胶霉素类化合物的生物合成途径具有重要的理论和现实意义。. 本项目首先建立了多节孢属真菌Nodulisporium sp的遗传操作系统，并在该菌株中建立了一种简便高效的基于CRISPR-Cas9技术的基因敲除法。同时，对该菌株进行了全基因组测序，结合生物信息分析、差异转录组分析以及基因敲除，我们首次鉴定了去甲氧绿胶霉素的生物合成基因簇，其包含19个基因，包括15个直接参与生物合成的基因。我们对15个基因进行了逐个敲除，通过分析和分离基因敲除菌株的代谢产物，结合米曲霉异源表达实验，我们阐明了去甲氧绿胶霉素完整的生物合成途径。在此基础上，利用体外酶催化和底物喂养等手段，证实了在去甲氧绿胶霉素的生物合成途径中，存在一种与哺乳动物甾体激素完全不同的孕烷侧链断裂机制，该断裂过程由三个酶通过三步反应完成。进一步的研究发现这三个酶也能催化孕酮的侧链断裂，为甾体药物的生物转化提供了新的酶工具。在研究去甲氧绿胶霉素的生物合成途径中，我们共分离获得了14个单体化合物，包括8个新化合物，我们测试了它们的PI3K激酶抑制活性，并揭示了新的构效关系。本项目首次阐明了去甲氧绿胶霉素的生物合成途径，将为全面揭示绿胶霉素类化合物的生物合成机制以及利用组合生物合成手段丰富该类化合物的结构多样性奠定基础。